張啟發組PNAS發表「化石」級研究揭示水稻光敏雄性核不育作用機理

BioArt按：2012年張啟發院士團隊在PNAS發表文章率先破解了光敏感核不育水稻的奧秘，這一重要成果的背後是該團隊25年不懈的堅持。而今天剛剛在線發表的這篇PNAS文章被張院士稱為「化石」級的研究，前後研究時間差不多接近30年。上述兩項研究背後都有著傳奇的故事，也充分反映了張啟發院士領導的學術團隊對科學真理孜孜不倦的追求，數十年的堅持或許就是要回答一個簡單的「為什麼」，這就是科學研究的價值和精神所在。有鑒於此，BioArt對今日在線發表的PNAS文章進行了詳細解讀，以饗讀者。

「化石」級研究揭示水稻光敏感雄性核不育作用機理

——華中農業大學張啟發課題組解析水稻光敏感雄性核不育作用機理

撰文丨宗偉 （華中農業大學生命科學學院博士）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上特別是中國最主要的糧食作物之一，養活了世界上近三分之一的人口。水稻雌雄同花，屬於自花授粉作物，以自交結實為主。千百年來水稻 的種植都是自交收種，依靠自然突變和人工選擇獲得對當地自然和栽培環境具有良 好適宜性的優良水稻品種，以提高水稻單株產量。上世紀50年代的第一次綠色革命利用矮桿基因培育出了矮稈、耐肥、抗倒伏的高產水稻，使得世界糧食總產量有了大幅提升。這種產量的提升還是基於水稻的自交結實，產量的提高潛力有限，但某些水稻品種之間進行雜交能獲得超過自交近20%的產量優勢。水稻特殊的花結構導致去雄困難，不可能在生產上大規模製備雜交種。直到1966年袁隆平提出了通過選育不育系、保持系和恢復系的三系配套法來實現雜交稻的生產設想，並在10年後應用於生產中，開始在全國大面積種植雜交稻。從那時起雜交稻在我國的種植面積逐年提升，到上世紀90年代至今一直超過了總種植面積的50%。

三系配套法中的不育系屬於細胞質雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS），植物的雄性不育現象還存在細胞核雄性不育。細胞核雄性不育通常由隱性基因控制，在生產上難以找到保持系，保持其後代的不育性，因此難以利用。直到1973年石明松發現了光敏雄性不育株農墾58S，農墾58S具有長日照下不育、短日照下可育的特性，利用這一特性在長日照下可以作為不育系，在短日照下作為保持系，一系兩用，大大簡化了生產流程（BioArt註：石明松作為項目第二完成人（第一完成人為袁隆平院士）榮獲2013年國家科學技術獎特等獎，然而此時他已經意外辭世26年了。1973年他發現的三株雄性不育系以後照亮了整個水稻世界，值得銘記）。後來我國育種學家們又找到了一類育性受溫度影響的溫敏雄性不育系，這些環境敏感性的細胞核不育系（environment-sensitive GMS，EGMS）是兩系配套法利用的核心。相對於三系配套，兩系不育系配套組更自由、恢復系廣、雜交制種過程簡化，在雜交稻生產上佔據了越來越重要的地位。對於細胞質雄性不育的機理已經研究的較為清楚，但對於環境敏感型的細胞核不育系的作用機理的研究則相對來說比較少。

圖片來自網路

近日，華中農業大學張啟發課題組在2016年12月12日的PNAS上以「PMS1T, producing phased small interfering RNAs, regulates photoperiod-sensitive male sterility in rice」為題，報道了在水稻光敏型雄性不育作用機理中發揮作用的另一個基因PMS1T，該基因能夠被miR2118識別並介導剪切，並從剪切位點開始形成一串21nt的phasiRNA，進一步研究發現這些phasiRNA在長日照下的農墾58S中的表達量明顯高於正常可育的對照品種。不包含完整miR2118識別位點的PMS1T則不能發揮正常的功能來降低長日照下的育性，由此表明PMS1T經過miR2118介導產生的phasiRNA在調控水稻光敏雄性不育過程中發揮著重要作用。值得注意的是，PMS1T 是到目前為止鑒定到的第一個具有生物學功能的PHAS 基因（能產生phasiRNA的基因），證明了這類小 RNA 對植物生長發育的重要性。

其實在這篇文章背後，除了PMS1T基因功能及其發揮作用方式的研究亮點外，更值得關注的是對這個基因定位的艱辛。這項研究被張啟發老師稱之為一個「化石」類的研究——歷史悠久，張老師課題組從1987年開始了光敏不育的相關研究，1994年定位到了這個基因位點pms1(photoperiod-sensitive male sterility1, 這是最開始的命名，之前報道pms3也是光敏不育的一個非常重要的基因，下文將提及)，這期間一直試圖克隆該基因。早在2001年就發表了對pms1的精細定位結果。通過秈型不育組合32001S/明恢63將pms1 定位於兩個分子標記Fssr和Rssr之間 85 kb 範圍內。後來構建了覆蓋該區間的6個互補載體轉化農墾58S後，發現這6個片段均不能恢復長日照下農墾58S的育性（該結果未發表）。於是改用農墾58S/明恢63組合對 pms1重新進行定位，最終將pms1定位在85 kb相鄰的21 kb區間內，分段互補仍然沒有能夠得到預期的結果（該定位結果最終並未發表）。在這樣的研究背景下，該篇論文的一作范優榮不得不考慮問題到底出在哪裡，仔細分析了前人的研究結果後，認為可能是群體中複雜的遺傳背景導致了定位的偏差。為了清除背景的影響，在農墾58S/明恢63組合中用農墾58S進行連續回交，最終通過對幾個高世代回交F2群體的分析發現農墾58S中的pms1不是隱性，而是顯性，並且這種光敏雄性不育特性表現為不完全顯性。這也解釋了之前無法通過轉基因驗證定位的結果：因為之前都是將隱性的pms1轉化至顯性的農墾58S中，那必然不會有效果。找對了方向，接下來精細定位的工作就進行得比較順利了，經過兩年多的努力，最終將pms1定位到一個3.8 kb的區間。將農墾58S的這段序列互補轉化到近等基因系中能顯著降低受體的育性，反過來將來自於明恢63的這段序列轉化到農墾58S中對育性沒有影響，說明定位區間內確實含有pms1的候選基因但在這區間內並沒有發現任何預測的基因。通過prime walking 以及5』RACE和3』RACE的方法，最終得到了pms1的全長cDNA，僅包含一個exon，隨後將該轉錄本命名為 PMS1T。對PMS1T進行RNAi和超量表達證實了就是pms1基因。PMS1T及其啟動子區在58S和明恢63之間僅存在四種序列差異，隨後通過遺傳分析、比較測序和轉基因驗證排除了其中三個變異位點，最終確定一個SNP的變異（不育為「T」,可育為「G」）導致了功能的差異。

其實研究做到這裡才只進行了一半，而這一半卻耗費了幾屆碩博研究生生的努力，三次精細定位，走了很多彎路。後續的研究，面對這樣一個完全未知的基因，如何解析它的功能又是一項挑戰。2012年張老師課題組對於另一個光敏不育相關基因pms3的定位克隆發現：由於一個SNP的差異（農墾58為「G」，農墾58S為「C」）引起pms3編碼的1, 236 bp長的long non-coding RNA, LDMAR的RNA二級結構發生了改變，造成其啟動子區域DNA甲基化程度的升高，抑制了基因在長日照下幼穗中的表達量，導致雄性不育。進一步研究發現LDMAR啟動子產生的21-nt的小RNA Psi-LDMAR介導了該區間的DNA甲基化。後來華南農業大學庄楚雄和劉耀光課題組的研究結果與此不謀而合，不過他們認為SNP附近產生的一個21 nt的小RNA（SNP位於小RNA的第11位上）可能更重要。兩個不同的課題組運用不同的光溫敏材料定位到了同一個基因，也同時解析了相似的作用機制。還是蠻有意思的。

張老師課題組解析水稻光敏核不育基因pms3功能的相關文獻

庄楚雄和劉耀光課題組發表的解析光敏和溫敏雄性不育基因及其作用方式的文章

回到開頭，在這項研究中作者起初也認為可能pms1的作用機制與pms3類似，因為實驗表明pms1也編碼一個lncRNA。但後續的實驗證明，兩者作用方式並不相同。序列分析發現PMS1T的5』端存在miR2118的識別位點，接下來的實驗也證實了miR2118能夠結合到PMS1T上，並介導對PMS1T的剪切。而水稻中miR2118主要參與介導形成21-nt的phasiRNA，miR2118結合到靶基因上後，會介導靶基因從剪切位點開始形成一串以21-nt為相位連續排列的小RNA，這類小RNA就稱之為phasiRNA。

小RNA測序的數據發現在PMS1T上從miR2118剪切位點開始確實能形成一系列的phasiRNA，共計18對。這些phasiRNA在體內是真實存在的，並且在長日照的農墾58S中表達量明顯高於對照材料，表明phasiRNA與光敏雄性不育相關，分析轉基因材料中phasiRNA的表達量進一步證實了該結論。而此前鑒定到的功能性鹼基突變位點就位於miR2118剪切位點後24 bp上可能導致在長日照的農墾58S中能產生更多的phasiRNA，一方面這些累積的phasiRNA可能造成了雄性不育；另一方面phasiRNA可能影響下游一些未知靶基因的表達從而導致了光敏雄性不育。

pms1 調控光敏感雄性核不育的作用機理

故事很長，也很精彩，十年的努力沒有白費，最終向人們揭示了一個物種進化過程又一個神奇的瞬間。但故事並沒有結束，因為我們並不知道這些產生的phasiRNA到底如何發揮作用？

感謝一作范優榮分享相關背景和研究結果。

華中農大作物遺傳改良國家重點實驗室大樓

（致謝：感謝宗偉博士對PNAS文章的精彩解讀！）