聖谷同創葉穎：ctDNA之路漫漫，吾將上下而求索

摘要

7月19日晚，火石百家邀請了北京聖谷同創科技發展有限公司副總裁葉穎博士，為大家分享「 ctDNA的臨床應用之路 」。葉博士在演講中介紹了ctDNA的前世今生、生物學特性、檢測平台現狀、產品設計要素等，並著重分享了聖谷同創在ctDNA領域的辛苦耕耘和精彩的臨床案例。

葉穎，醫學博士，聖谷同創副總裁，畢業於美國約翰霍普金斯大學醫學院分子病理學專業。20年生物技術和醫學研究經驗，側重腫瘤超早期診斷，白血病機制研究，造血幹細胞移植，分子病理及高通量測序技術在臨床檢驗中的應用。4年臨床醫師、10年研究平台和獨立醫學實驗室管理運營經歷。具有成功領導科研項目實施和臨床轉化的經驗，在國際期刊上發表過多篇論文。

分享環節

ctDNA因其廣泛的臨床應用前景，已成為目前學術界和投資界追逐的熱門話題。但它到底能不能克服臨床應用的考驗，通過國家相關部門的監管，在臨床得到廣泛的應用呢？希望今天的分享能帶給大家一些啟示。

循環腫瘤DNA的前世今生

1948年

發現人體外周血中存在游離DNA

1977年

發現化療後癌症病人體內游離DNA迅速下降

1994年

胰腺癌病人體內發現帶有KRAS突變的游離DNA

1997年

懷孕婦女血漿中發現胎兒游離DNA Lo，開啟了無創產前診斷領域的革命

21世紀

迅速成為研究的熱點，重量級文章頻發，進入臨床應用探討模式。

循環腫瘤DNA的生物學特性

ctDNA的檢測平台現狀

從最初的定量PCR技術，到現在的數字PCR和二代測序技術，對ctDNA的檢測逐步實現了高敏感度和高通量。以下是幾種ctDNA測序平台的對比：

ctＤＮＡ臨床應用

腫瘤突變組合就像萬花筒，原發灶與轉移灶、治療前與治療後、同一原發灶的不同克隆，突變的組合都不盡相同。

血漿中的ctDNA承載了這些不同，因此ctDNA在臨床上可應用於：明確腫瘤分子分型、監測療效、耐葯發現、微小殘留監測、預後評估、複發監測等。隨著ctDNA監測技術敏感性和特異性的提升，甚至可用於輔助腫瘤早期診斷和高危人群篩查。

ctDNA臨床應用產品設計要素

目前已有許多研究證實ctDNA的臨床應用是可行的。除此之外，一項實驗室技術真正成為臨床檢測技術還需要考慮哪些問題呢？

如何選擇檢測平台？

ctDNA的檢測平台主要分2種，PCR或NGS。它們的技術特點各有優劣。

選擇哪一種平台，需要綜合考慮以下因素：檢測目的、樣本的量、時間的要求、檢測已知少量位點還是多基因多位點、如何通過法律法規監管、選擇什麼的建庫方式、應用於醫院還是獨立醫學實驗室。

如何選擇檢測Panel?

需要綜合考慮以下因素：具體的臨床應用目的、如何通過法律法規監管、富集的方法。

檢測後分析如何？

生物信息資料庫：越豐富越好；

醫學信息資料庫：越新越好；

積累樣本：越多越好；

數據處理：分析能力越強越好。

判斷分析的好壞,主要從以上幾個方面考慮。

另外，血液標本的採集、儲存及檢測過程的標準化和自動化也是設計ctDNA臨床應用產品需要考慮的重要因素。

總之，一個好的臨床檢測產品需要滿足快速、精準、低成本、易操作和流程標準化的要求。

聖谷檢驗的ctDNA之路及案例分析

1、平台選擇

2014年，我們開始研發ctDNA產品，選擇了半導體高通量平台。這個平台夠快、夠准、對樣本需求量小、通量合適，適於醫院使用。

通過不斷的積累，目前有近3萬例的多癌種組織樣本基因變異數據，其中800例腫瘤患者有配對的不同時間採集的血漿樣本。數百例正常人的血漿、白細胞突變組數據可以作為對照，有效排除SNP的影響。

2、panel的設計和優化

Panel的設計比較靈活，既有專門針對單個癌種的，也有針對多個癌種的。在ctDNA檢測的過程中，我們對關鍵質控環節進行了優化。

游離DNA提取優化：操作更便捷，濃度和純度更高；

DNA起始檢測量降低至1ng，測序準確度達到99.99%，最低檢測突變丰度可達到0.5%；

突變過濾演算法優化：降低背景噪音；

整個檢測流程標準化。

3、臨床驗證研究

完成了實驗室方法學的驗證之後，我們開始與多家醫院合作，進行臨床驗證研究。

舉例：晚期肺癌ctDNA突變檢測臨床驗證

用二代測序方法對147位III-IV期非小細胞肺癌病人的外周血血漿ctDNA及腫瘤組織DNA分別進行50個腫瘤相關基因體細胞突變檢測，將獲得的結果與腫瘤組織結果對比：一致性為88%; 敏感性為92%;特異性為85%（聖谷與天津總醫院及北大人民醫院胸外科合作研究數據）。

4、案例分享

測序深度：聖谷的平均測序深度是10000X。如此高的測序深度觀測到的突變有臨床意義嗎？

積累的數據顯示：當ctDNA與組織樣品突變陽性一致，突變丰度

Off-label用藥：女病人，63歲，卵巢癌術後11月余，發現左鎖骨上包塊1月，疑複發入院，開始使用傳統化療方案——吉西他濱+順鉑，1月後不見好轉。ctDNA發現EGFR p.L858R突變，使用TKI抑制劑凱美納，病情緩解，CT提示轉移灶縮小。

肺癌動態監測：女病人，46歲，乾咳1月余，CT發現肺佔位1周，診斷：肺癌並多發轉移。術前ctDNA提示EGFR L858R突變，隨後開展動態監測，監測周期1月/次。手術很成功，術後ctDNA明顯下降，應用傳統化療方案——培美曲賽+順鉑，ctDNA從藥物使用後第二個月開始上升，持續到4.5個月，臨床評估疾病進展。更換為吉非替尼，ctDNA迅速下降，影像學確認瘤體縮小。

上圖中，紅線代表ctDNA丰度變化，綠色代表腫瘤大小變化。可以看出，EGFR L858R的ctDNA突變丰度與影像學檢查一致，而且靈敏度更高，可提前監控癌症進展。

結直腸癌動態監測：16位III-IV期結直腸癌患者，接受FOLFOX一線化療方案，在化療前及一個療程結束後抽取外周血進行ctDNA檢測，並對比兩次檢測之間的突變丰度。根據影像學結果把患者分為SD,PR,PD三組。

可以看出，ctDNA突變丰度變化與臨床評估一致。

總結

ctDNA臨床應用漸行漸近，但離進入臨床實踐還有距離。目前，ctDNA的臨床應用還需要大規模實驗的驗證。我們希望ctDNA能打開腫瘤個體化治療的寶庫，讓上百萬的腫瘤病人最終受益。

問答環節

提問1：請問聖谷的ctDNA檢測的性能參數指標，尤其是早期腫瘤的檢測結果比其他文章發表的數據都要稍微好一些，原因是什麼？

葉博士：剛才提到產品設計的多個要素。其中，我們從DNA 的提取到建庫方法的建立，到分析演算法的驗證都申請了專利。在這些因素綜合下，我們的敏感度和特異性都比較高。

提問2：請問ctDNA目前國內市場競爭格局怎樣？有多少企業在做，有沒有營業收入？其技術壁壘在哪裡？同時工藝的難易程度如何？

葉博士：目前有幾十家企業，但是規模都是很大，營業收入沒有披露，但ctDNA處於臨床驗證階段，所以收入估計不多。技術壁壘方面，各家公司都有專利，但重疊部分不多。除了技術本身，後續分析也很重要。測序本身的工藝難度並不是很大，從樣本採集，到建庫方式選擇，到擴增方式選擇，再到分析演算法，這一整個流程下來，多個環節都會影響準確度。這是一個集成性的技術，影響因素多。

提問3：由於ctDNA屬於新興項目，很多臨床醫生覺得這個檢測的意義不是特別大，從哪個點可以說服醫生接受這個項目呢？

葉博士：可以從傳統活檢的檢測難點入手：腫瘤的異質性、腫瘤病人術後取不到組織樣本、轉移灶不易取得，此時用血漿ctDNA檢測可以獲得很多有用信息。液體活檢是組織活檢的有效補充。

提問4：您好，剛才在講課過程中有提到貴公司使用ctDNA的量可以是1ng，約等於300個基因組，請問貴公司的平均有效測序深度是多少？對於少量的ctDNA，例如1ng，請問如何做到0.5%？有多少有效突變reads支持時認為是可靠的突變？

葉博士：我們的ctDNA檢測一般使用2ml的血漿，可以產生20-200ng的ctDNA。通過建庫方法優化可以將量將到1ng，但不代表每個檢測都要維持這個量。1ng ctDNA中約只含300個基因組拷貝，測序過程中的PCR擴增可將300個基因組拷貝擴大至10000以上，另外，我們優化的實驗方法可選擇性抑制gDNA擴增，高效的保證ctDNA有效擴增。我們要求平均測序深度大於10000X，可靠的突變不單只看有效reads數，還要考慮其它質量指標，如總覆蓋度、區域均一性、鏈偏向性等。

友情提示：嘉賓觀點不代表「火石創造」立場

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