環狀RNA也可能表達多肽

知識 07-29

近日，墨西哥兒童醫院的Javier T. Granados-Riveron和Guillermo Aquino-Jarquin在Biochimica et Biophysica Acta雜誌撰寫了綜述論文，討論了關於環狀RNA表達多肽的最新發現和理論推測 (Javier T. et al. 2016)。

環狀RNA也可能表達多肽

作者一開始著重介紹了環狀RNA形成機制和作為miRNA Sponge功能以及調控轉錄作用的功能模型，我們在早期的一些文獻跟蹤報道中曾詳細介紹過，在此不再贅述。接下來重點介紹了環狀RNA可能直接翻譯出多肽的最新發現。下面就讓山人跟大家一起詳細學習一下這篇綜述文章吧。

環狀RNA也可能表達多肽

圖1 目前已知的環狀RNA表達多肽的證據（來自(Javier T. et al. 2016)）

早在1984年，H. SCHELLEKENS等就曾在Nature上發表文章發現hepatitisδ virus（HDV）病毒中包含著單鏈環狀RNA，並且該環狀RNA可以表達一條122個氨基酸的多肽。這是人類關於環狀RNA表達多肽最早的文獻報道。

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圖2 HDV病毒的單鏈環狀RNA表達多肽（來自(Zheng et al., 2016)）

2014年，Tauqeer Ahmad發表於PNAS的一篇文章證明在水稻中被一種220nt的環狀RNA構成的擬病毒感染後會在這種可複製的環狀RNA分子上表達出一個16kD大小的蛋白分子。

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這種稱為rice yellow mottle virus (sobemovirus) (RYMV) 的擬病毒可造成水稻黃斑病變。該擬病毒僅由220nt的閉合環狀RNA構成。RYMV編碼蛋白的機制非常奇特，我們可以初步估算一下就會發現其中玄妙之處：如果220nt全部作為密碼子，最多可編碼73個氨基酸，按照每個氨基酸分子量110估計，73個氨基酸最多只有8kD左右大小，實際情況是該擬病毒編碼了一中16kD的蛋白！玄妙之處在於它採用了一種重疊編碼的策略，就是在第一次走完環狀RNA全部序列之後在起始密碼子前的一個鹼基和起始密碼子的「AU」繼續作為ORF的密碼子進行第二輪編碼，再次到達起始位點的時候，原先起始密碼子的「A」與前面的兩個鹼基「UG」構成了第一終止密碼子，後面還有第二和第三終止密碼子存在，因此個別情況下還會表達出18kD或23kD大小的蛋白。這一文章的發現非常奇特，也只有在環狀的分子形式才可能出現重疊密碼子的情況。

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圖3 RYMV環狀RNA表達蛋白採用重疊密碼子形式（來自(AbouHaidar et al., 2014)）

在高等真核生物中除了常規的基於5』-Cap結構的蛋白翻譯起始機制外，一些經常存在於病毒中的Internal Ribosomal Entry Sites (IRES)元件也可以直接啟動核糖體的組裝和翻譯起始。有幾篇文章就曾在體外和體內設計的體系中驗證過有IRES元件的環狀RNA可以啟動蛋白翻譯作用。包括Wang ZeFeng在2015年發表於RNA雜誌的文章(Wang and Wang, 2015)，介紹人工構建的含有IRES元件的反向拼接形成的環狀RNA可表達完整的GFP蛋白。此外，Sarnow, P.在1995年發表於Science的文章也在體外證明攜帶IRES元件的環狀RNA能正確表達多肽(Chen and Sarnow, 1995)。Ares, M在1998年發表於RNA雜誌的文章也證明在大腸桿菌中環狀RNA也可以正確表達GFP蛋白(Perriman and Ares, 1998)。Abe, H.等也曾於2015年在Scientific Reports雜誌發表文章證明體外可以實現不攜帶任何翻譯起始調控元件（如IRES或Kozak序列等）的環狀RNA就可以在兔網織紅細胞體外翻譯體系中實現ORF的翻譯過程(Abe et al., 2015)。這些研究工作都初步表明環狀RNA完全可以與線性DNA一樣具有翻譯蛋白的作用。

有趣的是，Jonathan Lytton曾於1999年在JBC雜誌發表文章表明發現NCX1基因的2號外顯子存在單獨環化的環狀RNA，該環狀RNA大小1799nt，包含了NCX1基因起始密碼子上游33nt的序列，由該起始密碼子的ORF經過環化後正好在環化位點後面8-10位位置形成了終止密碼子。因此作者推測該環狀RNA能獨立表達600個氨基酸構成的分子量大小約70kD的蛋白。過表達該蛋白證明可以有活性，但作者未能在體內體系中鑒定到70kD的蛋白存在。(Li and Lytton, 1999)。

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圖 4 NCX1二號外顯子環化後形成可表達蛋白的獨立ORF （來自(Li and Lytton, 1999)）

非編碼RNA往往不具備典型的蛋白翻譯調控序列，但一系列的研究表明一些RNA分子雖然被定義為非編碼RNA，但還是有足夠的證據證明可以編碼蛋白和多肽的。UCSF的Jonathan S. Weissman教授先後開發了一系列鑒定具備編碼功能的RNA序列的方法體系，他們曾在2009年在Science雜誌發表了一種基於分離80S核糖體保護的RNA片段深度測序的方法體系，用於鑒定能夠結合核糖體的RNA序列(Ingolia et al., 2009)。藉助該技術，他們於2011年在Cell發表文章，發現了一些多順反子形式的核糖體相關編碼小肽的RNA（sprcRNAs）(Ingolia et al., 2011)。2013年，Eric S. Lander發表於Cell的文章提出了ribosome release score (RRS)的鑒定是否真實的進行核糖體翻譯作用的評價指標(Guttman et al., 2013)。還有一些其他的作者也曾嘗試找到環狀RNA直接表達多肽的證據，但暫時還沒有太有說服力的研究結論。

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作者還介紹了幾個有用的分析環狀RNA翻譯功能和ORF的信息學工具：ORF Finder：可用於分析核酸序列中可能存在的ORF。IRESite可用於分析目標序列中可能存在的IRES元件。CPAT可用於評估RNA編碼多肽的可能性。Pfam 29.0可用於評估預測的多肽序列的基本特徵。PhyloCSF可用於相關的進化分析。CircInteractome可用於分析目標環狀RNA相互作用的miRNA或蛋白及其作用位點。

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圖5 有用的預測分析環狀RNA表達多肽的工具（來自(Javier T. et al. 2016)）

總之，目前在哺乳動物中還沒有直接的證據表明環狀RNA可以翻譯蛋白，但一系列的線索又非常支持這一假設。就在前幾天召開的環狀RNA研究論壇上，暨南大學的張弓教授也在他們翻譯組學的分析平台中找出了一些環狀RNA表達多肽的線索，相關結果暫未發表。這些線索和相關研究背景非常支持環狀RNA會表達多肽的假設，各位同行可以針對自己感興趣的環狀RNA進行這方面的分析預測，或許會有意外的驚喜。

參考文獻：

Javier T. Granados-Riveron, Guillermo Aquino-Jarquin. (2016). The complexity of the translation ability of circRNAs. Biochimica et Biophysica Acta. Published Online.

Abe, N., Matsumoto, K., Nishihara, M., Nakano, Y., Shibata, A., Maruyama, H., Shuto, S., Matsuda, A., Yoshida, M., Ito, Y., et al. (2015). Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Sci Rep 5, 16435.

AbouHaidar, M.G., Venkataraman, S., Golshani, A., Liu, B., and Ahmad, T. (2014). Novel coding, translation, and gene ex pression of a replicating covalently closed circular RNA of 220 nt. Proc Natl Acad Sci U S A.

Chen, C.Y., and Sarnow, P. (1995). Initiation of protein synthesis by the eukaryotic translational apparatus on circular RNAs. Science 268, 415-417.

Li, X.F., and Lytton, J. (1999). A circularized sodium-calcium exchanger exon 2 transc ript. J Biol Chem 274, 8153-8160.

Perriman, R., and Ares, M. (1998). Circular mRNA can direct translation of extremely long repeating-sequence proteins in vivo. Rna 4, 1047-1054.

Wang, Y., and Wang, Z. (2015). Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA 21, 172-179.

Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., Luo, Y., Lyu, D., Li, Y., Shi, G., et al. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun 7, 11215.

文 | circRNA 吉賽生物

本文為作者授權肽度時界發布

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