Western Blot：想說愛你也容易！

知識 07-07

Western其實是大多數人的痛，你的WB做的好算是你老闆撿到寶，WB做不好，畢業畢不了。今天小編給大家帶來的都是乾貨，其實我想說WB,想說愛你也容易！

一、原理

與Southern或Northern方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。

二、實驗材料及步驟請參見分子克隆

三、下面是小編給大家帶來的乾貨：實驗常見的問題指南

5. Marker的相關疑問

MM. 我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請問什麼原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。

NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恆壓10V45min轉印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但儘管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！

解答：1、「我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。」有的時候，Prestained Marker 放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。

2、「前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但儘管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。」轉移時半干法建議用恆流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。

3、「再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。」

是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這麼大的蛋白最好轉移時間延長到1.5hrs。

6. 染色的選擇

O O. Western Blot哪種染色好？

解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到 1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測後容易從蛋白質中除去，以便進行隨後的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。

（2）膠體金，靈敏度高，檢測範圍可到pg級，但染色比穩定。

（3）生物素化靈敏度位於1、2之間，可用於任何一種膜。

7. 參照的疑問

PP. 是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？

解答：對於發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。

QQ. 用BANDSCAN分析結果行嗎？

解答：分析一般的結果沒問題。

R R. 核內抗原Western Blot內參選擇什麼合適？

解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。

S S. 轉膜時採用電流是否比電壓準確，是否根據0.8mA/cm2，一般1小時左右？

解答：不是的，半干法推薦用恆流，一般根據目的蛋白的大小來確定電流和時間。

T T. 做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內參B-actin，GAPDH，那個好？

解答：選用beta-actin就可以。

8. 緩衝液配方的常見問題

UU. 轉膜後的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什麼？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？

解答：轉膜後的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。

VV. 準備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質位於細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發生？

解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。

WW. 想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什麼原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？

解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。

X X. 最近作了兩次Western Blot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其餘同三去污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。後兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會是封閉液的問題吧？

解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1. 封閉液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。

Y Y. 加甲醇的目的是什麼？

解答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。

Z Z. 「轉膜後的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉」，其中TBST最後那個T是Tween嗎，濃度多大？

解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.

AAA. 封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什麼規定呢，比如現在我就在室溫里做，或者要在4度下?

解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然後4度過夜。

BBB. 實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用於抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用於抽提細胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解緩衝液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脫氧膽酸鈉， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 μg/ml)不知對於膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制劑？

解答：做２－Ｄ絕對不推薦使用ＮＰ－４０（因為即使進口的ＮＰ－４０也不純，，其中的雜質會影響質譜結果）。對於動物細胞，其蛋白酶活性較弱（相對於組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因為7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ構成的變性環境已經足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ對於抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議採用分級抽提法。此外還可以採用梯度離心法和一些基於去垢劑的方法。ＥＤＴＡ用於滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導致蛋白質的修飾，做ＷＢ無所謂，做ＭＡＩＬＤＩ時會給正確鑒定帶來麻煩。裂解緩衝液中少了兩性電解質(在2-D裂解緩衝液中，兩性電解質起的作用：提供連續的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦採用SDS，因SDS會與蛋白質結合導致其等電點發生改變，如果您實在要用，終濃度降到0.1%以下。

9. 條件的摸索

DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加D A B肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜後，麗春紅染色發現大分子量蛋白轉過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪裡出了問題？

解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。

2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。

3、轉膜，建議恆壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，並不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經也轉過2小時，但和45分鐘的區別並不大。

4、根據MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。

5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗濃度。

6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。

EEE. 電泳用的是恆流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恆流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。

解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時溴酚藍和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時間。建議你用恆壓80－100伏。

FFF. BIO-RAD的半干轉運系統有一個很致命的弱點就是無法控溫（我用的就是這種），當電流過高，而系統的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。

就轉膜時，是採取恆壓還是恆流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個系統用恆流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恆流來轉膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恆壓，開始電流有110mA，但15min後，電流就降到8OmA，30min後就穩定在40mA，不就相當於恆流嗎？

解答：恆流時電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流30min以後20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠40cm2，不知有無不同。

G G G. 我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什麼大小蛋白）不知道有那些辦法？

解答：不管怎麼轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉膜，下半時間短，上半時間長一點，應該會好一些。

HHH. 請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什麼？

解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反覆洗幾次後，蛋白容易掉下來，結果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（註：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

III. 1、煮好後的樣品，若沒有及時上樣分離，應如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊？3、濕式轉移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恆壓轉移的條件如何確定，因為我要分離小至21KD，中至66KD，大致 170KD的蛋白質，轉移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量範圍不同，還給出了一個線形範圍，是不是不在這個範圍內也能分離，只是就不是線性範圍了？

解答：1、煮好後的樣品，放到-20，我們在一個月後此樣品，效果一樣。

2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。

3、轉移時一般的WATERMEN濾紙就可以。

4、轉移條件是和蛋白質大小有關的：以次確定電壓和時間。具體可讓ptglab幫你定奪。

5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質大小有關。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。

J J J. 怎樣設計實驗來確定最佳的條件？

解答：隨便說一點，具體的還是需要自己想：

1、在每個上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1 個大 well，不插梳子，多上樣，）SDS-page；

2、轉移，設定電流或電壓；

3、每隔 1（or n）小時，取一點膜染色，看轉移效果。

T T T. 目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮後採用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％T丙稀醯胺（2.6％C）濃度為16.5％，另外兩層都用30％丙稀醯胺，中間一層濃度為10％，積層膠濃度為4％，凝膠厚度1mm，轉膜的條件試過30V70分鐘，膜上可見到小分子蛋白marker的條帶，似乎見到目的條帶，上樣量為60μg細胞胞漿總蛋白，轉膜的條件怎麼樣合適？

解答：一定要用0.2μm的膜，並且轉移的條件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根據你的實驗器材來定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應的分子量大小的marker轉移的好就可以了。

U U U. 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什麼技巧嗎？想跑漂亮，是不是應該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會跑的好些?還有前面有人說電泳液平玻璃板會使電泳條帶漂亮些?

解答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要乾淨，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。

V V V. 為什麼提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什麼原因?

解答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以後，有一部分小分子的就透過去了。

WWW. 上次轉染了1.6*106細胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進分離膠，在100v電泳至溴酚蘭出膠，biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘，預染marker全部進膜，轉移後的膠考馬斯亮蘭染，可見殘留的蛋白帶，大分子量多些. blot時，封閉用5%奶粉TTBS 1小時，抗體稀釋液TTBS，一抗(1:10，單抗上清，2000年製備)1小時，二抗(1:2000)1小時，均在室溫.結果，50kd的小分子顯色， 160kd大分子未顯色。

原因分析及準備改進：轉染大容量的質粒(融合蛋白的質粒)的效率會相對較低，大分子量表達也會相對較低，加上大分子量蛋白的轉移不完全，可能是我沒有拿到大分子量條帶結果的原因。另外背景稍微有一些臟(背景整體均勻一致)，估計是二抗的濃度高了些，準備降至1:5000，另外抗體稀釋液準備改用5%奶粉TTBS，封閉改為室溫2小時。這個過程有沒有問題？

解答：首先分析你的整個實驗步驟。我發現了兩個比較大的毛病：

1、一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。

2、「biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘」，你是這麼做的嗎？因為我大部分時間是做的恆流轉移，用的是0.1mA/膜，100kd-- 200kd轉2小時。到最後電壓會升到20v左右。你用恆壓法，我不是很肯定你轉30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉上去。我建議你最好能將時間延長，如果是恆流，可按我的做法；如果是恆壓，可摸索一下，適當延長時間。有時候你的marker也有可能欺騙你，因為marker的量比較大，是很容易轉上去的，實際上目標蛋白的量遠遠少於marker量。

我對你的結果分析如下：

1、你的結果很好，估計離目標不遠了，很快就可以成功。

2、沒有160kd的帶是因為你的轉移時間過短，適當延長轉移時間（我懷疑這是主要的問題）。

3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景會低一點。

10. 方法的介紹

XXX. 我想將hbx轉到hepg2 細胞里通過檢測hbx蛋白的水平來檢驗轉染的效率不知道可不可行？

解答：Western Blot檢測HBX蛋白的表達來檢測轉染效率不是一個好辦法，建議還是：

1、最好是帶有熒游標簽的HBX轉染來看轉染效率，最可靠

2、其次，HBX和熒光載體共轉染，相對說明問題

3、熒光載體單獨轉染，主要是看細胞好不好轉了呵呵

轉染效率高低熒光顯微鏡下一目了然了。有的細胞熒光強，有的細胞熒光弱，有的沒有。所以HBX表達強很可能是少數細胞熒光強的結果，不代表轉染效率。

YYY. 半干法轉移與膠的面積和蛋白分子兩大小好像都有關係，那麼濕法轉移是不是所有的轉移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？

解答：半干轉的電流大小是按照面積來算的，時間是根據蛋白分子大小定的；而濕轉的話電流是恆定的，時間也是根據分子量而定。

ZZZ. 轉膜時何為濕法，何為半干法？

解答：半干法和濕法轉移是兩種不同的轉移裝置下的轉移系統，將膜，膠，濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉移體系的叫半干法。

AAAA. 為什麼濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？

解答：濃縮膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠，如果電壓太大前端的蛋白容易在後面的蛋白趕上來前進入分離膠。而在分離是理論上（實際上也是）小電壓長時間分離的效果會更好，但是在操作過程中沒有必要等那麼長的時間，所以就用大電壓快點跑。

BBBB. 如果目的蛋白比較小，21和38kd，轉膜時（Biorad的濕轉儀）時間是否能縮短些？100伏電壓，甲醇的量是否也可以相應增加？

DDDD. 顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，後來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移後染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什麼條帶老是不粗不濃呢?

解答：可能跟你的一抗有關係，還有應該高表達，那實際做的陽性對照是否是高表達；還有跟抗原量相關，你多上點蛋白會好的多；跟顯色條件相關。

EEEE. 背景很花，當然條帶也很淡，如果我在顯影液中多洗一會兒，背景就很深，以致無法辨認，但有時條帶又很明顯，背底很淡。

解答：這跟你washing的時間和強度有關，很可能你在這方面沒有掌握好。顯影時間是有範圍的，久了肯定不行。

FFFF. 純化過的目的帶包括其上下都出現了色帶，而且對照菌也出現了條帶，會是什麼原因?

解答：一抗有問題，效價太低，且未純化；表達量太低；提蛋白時可能出了問題。

G GGG. 做Western Blot的檢測的時候，用DAB顯色還能看出條帶，但是換成ECL的時候什麼樣結果都沒有。我用的NOVA公司的發光底物，膠片是普通的X片，定影液和顯影液都是別人留下來的，不知道是什麼原因？

解答：一般的說，Ecl比DAB更靈敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有幾種可能：

ECL底物失活了，你可以檢測一下；敏感度正好不到ECl底物的範圍。DAB能顯色可不能催化ECL底物；顯影液沒用了。

HHHH. 怎樣分析結果，需要什麼軟體?

解答：如果你做定量或辦定量，至少要用到一個光密度掃描分析軟體，如果不是，直接分析就可以了。

IIII. 積層膠、分離膠一般多少左右合適？

解答：一般電泳是積層膠60-80v，分離膠100v。

採用生物素標記的二抗－SABC-DAB檢測系統做western，非特異性的條帶和背景高？總蛋白考染的時候發現接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起了，這是什麼原因，如何解決？sds－page的時候恆壓和恆流哪個好？

解答：非特異性的條帶和背景高：可能性太多了，一抗，二抗，封閉的原因都可能。總蛋白考染的時候發現接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起了，這是什麼原因，如何解決？正常的，另外，是否是你的積層膠有問題。sds－page的時候，恆壓和恆流都可以用。

KKKK. 血清樣品進行Western Blot 分析，目的蛋白21kD，結果顯色出來後，目的條帶很淡，而白蛋白和IgG條帶很濃？

解答：可能是因為白蛋白為67kD和目的蛋白相差教大，且他的濃度較低，你可以以底物二氨基聯苯胺和0．01％過氧化氫溶液顯色的時間延長為30分鐘，再用去離子水漂洗以終止反應;也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時間延長，同時提高封閉液的濃度，可以減少以下背景噪音。同時洗的時候要徹底，而目的條帶弱，說明濃度不足，如果不考慮後續功能的話，你可以過G-50（細）柱子，純化你的靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很漂亮的結果。

LLLL. Western轉膜已經成功了，但是Marker泳道未見蛋白條帶（正常應該有6條），其餘各泳道均有清晰的蛋白條帶，經考馬斯亮藍染膠，結果相同。經5％的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘後，進行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個半小時（1：2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現蛋白條帶，但較弱，且出現非特異性條帶。請問：1、Marker是MBI公司的，可分離14-116KD的蛋白，買了大概有一年的時間，是否有問題？2、一抗（為多克隆抗體）、二抗的濃度及孵育的時間是否合適？

3、封閉的時間是否太短？

解答：1. marker 有可能被降解了，也有可能是它標稱的上樣量太少，不夠，我做過一個標稱每次5ul可我上了20ul才行的。

2.建議，一抗4度過夜也很好，建議1:100，室溫2hrs就夠了，

3. 二抗室溫1小時，1:2000，我喜歡4度封閉過夜（室溫2hr就夠了），1抗室溫1hr，2抗室溫1hr，最好是一抗4度過夜（或室溫2小時）1:200，2抗室溫1小時1:2000，換ECL法。

Western Blot：想說愛你也容易！