基因編輯技術CRISPR/Cas9有望攻克鯉科皰疹病毒3型疾病

鯉科皰疹病毒病（KHVD）是由（CyHV-3），又稱錦鯉皰疹病毒（KHV）感染鯉魚和錦鯉引起的一種急性傳染病。目前，對於該病的治療尚缺乏有效方法，給我國鯉魚養殖帶來了巨大的經濟損失。

近期，東北林業大學、吉林大學聯合利用基因編輯技術CRISPR/Cas9（圖1），在體外鯉魚鰭條KF-1細胞系中成功抑制了KHV病毒的複製。CRISPR系統是細菌的一種獲得性免疫系統，細菌被病毒侵染後，可截取病毒DNA片段整合進入基因組。當細菌再次被病毒侵染時，便可造成病毒基因組DNA中特定位置的雙鏈斷裂，從而抑制病毒在胞內的複製，對其形成免疫。

圖1  CRISPR原理圖

利用CRISPR原理，東北林業大學趙翊丞、於澤等依據KHV基因組TK和DP基因設計了crRNAs，並在crRNA-TK和crRNA-DP引物的作用下，擴增得到兩個帶有BbsI酶切粘性末端的DNA雙鏈退火產物。將擴增產物分別連接到含有puromycin抗性基因的pX330-puro載體上，轉入感受態細胞後進行PCR驗證，最終得到陽性重組質粒pX330-puroTK和pX330-puroDP。

完成質粒構建後，通過細胞試驗對兩個重組質粒抑制KHV病毒複製的效果進行了評估。首先，利用KHV病毒敏感細胞系KF-1感染KHV病毒後，加入pX330-puro TK和pX330-puro DP混合質粒轉染細胞系，並採用熒光定量PCR和病毒的半數細胞感染量測定KHV在轉染細胞中的增殖。同時，將pX330-puro TK和pX330-puro DP轉染正常KF-1細胞系，通過篩選成功轉染的陽性細胞並培養後，接入KHV毒液培養7天，利用熒光定量PCR以及病毒滴度測定法對病毒增殖進行檢測。以上兩項試驗結果均顯示（圖2），pX330-puro TK和pX330-puro DP能有效抑制KHV病毒在細胞內的複製。

圖2  細胞實驗結果圖

通過試驗證明，該技術對於定向敲除KHV關鍵基因的靶向精確性高，使得細胞內病毒複製得到有效抑制。這為早日攻克鯉科皰疹病毒3型病毒病提供了一種新思路、新方法。 

來源：Inhibiting cyprinid herpesvirus-3 replication with CRISPR/Cas9，Biotechnology Letters，2015，38(4)：1-6

作者：劉衍鵬 水產動物疾病防控國家工程實驗室

本稿為水產養殖動物疾病防控技術國家地方聯合工程實驗室原創編譯整理，轉載須經過同意並註明來源、作者

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