肺腺癌ROS1融合基因的檢測及臨床病理特徵
作者：劉盡國、趙瑞英、滕昊驊、張傑
來源：中華病理學雜誌
以分子靶向治療為核心的個體化綜合治療已經成為肺腺癌治療的熱點。EGFR-TKI一線治療表皮生長因子受體（EGFR）基因突變患者和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）融合基因的非小細胞肺癌（NSCLC）靶向治療的成功推動了肺癌個體化治療的進程[1]，而越來越多的肺癌相關靶向分子如ROS1、HER2、BRAF、PI3KCA、MET等的檢測受到關注[2]。2007年Rikova等[3]首次在肺腺癌細胞株和肺腺癌患者組織中分離出ROS1融合基因，該基因可能成為繼EGFR及EML4-ALK後肺腺癌治療的新靶點。為初步了解肺腺癌患者中ROS1融合基因概況，我們採用即時熒光PCR法（RT-PCR）對369例已知EGFR突變狀態的肺腺癌手術切除標本進行ROS1融合基因檢測，旨在分析和探討肺腺癌中ROS1融合基因的分布狀況及其與臨床病理特徵之間的關係，為臨床ROS1融合基因陽性的肺腺癌患者的個體化治療提供可靠依據。
一、材料與方法
1.臨床資料：
收集369例上海市胸科醫院/上海交通大學附屬胸科醫院2013年1–11月期間，手術切除（葉切、段切或楔切）且經病理確診的術前未經抗腫瘤治療的肺腺癌患者石蠟包埋腫瘤組織。其中男性186例、女性183例；年齡範圍27～84歲，平均年齡59.5歲，中位年齡60歲，按中位年齡分2組：≤60歲195例，>60歲174例；有吸煙史患者51例，無吸煙史318例。高分化患者39例，一般以貼壁為主，不伴有微乳頭狀和/或實性成分；中分化患者162例，一般以腺泡狀或乳頭狀為主，可伴有少量微乳頭狀和/或實性成分（
2.RNA提取：
由高年資病理醫師根據HE切片選取用於基因檢測的標本蠟塊，每個切片均採用新的刀片以避免交叉污染，取5片5 μm厚度石蠟切片組織，置於1.5 mL EP管內。使用甲醛固定-石蠟包埋組織的RNA提取試劑盒（RNeasy FFPE試劑盒，購自Qiagen公司），提取並純化石蠟組織的RNA，具體步驟按試劑盒操作說明進行。
3.ROS1融合基因檢測：
採用RT-PCR法檢測14種融合突變，人類ROS1融合基因檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司。將從石蠟包埋組織中提取的RNA經逆轉錄生成cDNA，再進行RT-PCR，儀器型號為Stratagene Mx 3000p。PCR反應條件分別為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環。收集熒光信號，進行數據分析。
4.基因檢測判斷標準：
ROS1融合基因的某一個融合基因檢測管中FAM信號擴增曲線Ct值
5.直接測序法：
抽取部分病例進行直接測序驗證，針對ROS1 14種融合突變設計引物（表1），並委託上海生工生物工程有限公司合成，將擴增出的PCR產物純化、測序。
表1 測序引物信息
6.統計學分析：
採用軟體SPSS 13.0軟體進行統計學分析，採用χ2檢驗評價ROS1融合基因突變與臨床病理特徵的關係，對行×列表資料含有理論頻數
二、結果
1.ROS1融合基因檢出率及其與肺腺癌臨床病理特徵的關係：
369例肺腺癌組織中有16例檢測出ROS1融合基因陽性，總陽性檢出率為4.3%。抽取16例陽性樣本和20例陰性樣本進行直接測序驗證，其ROS1陰陽性檢出與RT-PCR法結果一致，兩種方法的總體符合率為100%。在369例肺腺癌患者中，ROS1融合基因與患者性別、年齡、吸煙史、腫塊位置、大小、組織學亞型（圖1）、分化程度、T分期、淋巴結轉移、TNM分期及EGFR突變狀態均無顯著相關性（P>0.05）。男、女患者ROS1融合基因陽性率分別為（4.3%，8/186）、 （4.4%，8/183），年齡≤60歲患者的ROS1融合基因陽性率（5.1%，10/195）高於>60歲患者（3.4%，6/174），非吸煙者的ROS1融合基因陽性率（4.4%，14/318）略高於吸煙者（3.9%，2/51），兩者差異無統計學意義（P＝0.876）；EGFR野生型患者的ROS1融合基因陽性率（5.6%，13/232）高於突變型患者（2.2%，3/137），差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖1肺腺癌的組織學亞型，A示貼壁為主HE低倍放大；B示腺泡狀為主HE低倍放大；C示乳頭狀為主HE中倍放大；D示微乳頭狀為主HE高倍放大；E示實性為主HE中倍放大；F示浸潤性黏液腺癌HE低倍放大
2.ROS1融合基因陽性患者臨床病理特徵：
16例ROS1融合基因陽性患者年齡範圍34～74歲，平均年齡57.4歲，中位年齡58.5歲。9例患者的年齡小於總體患者的平均年齡，7例患者的年齡大於總體患者的平均年齡。男性8例，女性8例。14例（14/16）患者不吸煙，2例（2/16）患者吸煙。腫塊大小0.8～6.0 cm，13例（13/16）位於右葉，3例（3/16）位於左葉。高分化患者1例（1/16），中分化5例（5/16），低分化10例（10/16）。在組織學類型上，按照2011年肺腺癌分類標準：腺泡狀為主（圖2）、乳頭狀為主（圖3）、實性為主（圖4）及浸潤性黏液腺癌（圖5），分別有8例、4例、3例和1例。在TNM分期中，8例患者為Ⅰ期，3例患者為Ⅱ期，4例患者為Ⅲ期，另1例患者沒有淋巴結清掃，T分期為T3。13例患者EGFR狀態為野生型，3例患者同時存在EGFR的21外顯子點突變（21L858R）和ROS1融合基因。
圖2腺泡狀為主、高分化肺腺癌組織，ROS1融合基因為SDC4 exon4-ROS1 exon34，A為實時熒光PCR法（RT-PCR），B為直接測序法
圖3乳頭狀為主、中分化肺腺癌組織，ROS1融合基因為SDC4 exon4-ROS1 exon32，A為RT-PCR，B為直接測序法
圖4實性為主、低分化肺腺癌組織，ROS1融合基因為SLC34A2 exon14 del-ROS1 exon34，A為RT-PCR，B為直接測序法
圖5浸潤性黏液腺癌、中分化肺腺癌組織，ROS1融合基因為CD74 exon6-ROS1 exon34，A為RT-PCR，B為直接測序法
三、討論
人類ROS1基因，定位於第6號染色體q22區，編碼2 347個氨基酸，相對分子質量為259 000[4]；屬於Ⅱ類受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）的胰島素受體家族。ROS1受體酪氨酸激酶參與激活多條下游信號轉導通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3、PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途徑，進而調控腫瘤細胞的生長增殖、細胞周期、分化、轉移和遷移[5]。ROS1基因和ALK基因在酪氨酸激酶區域序列存在49%同源性，而在激酶催化區的ATP結合位點二者同源性高達77%，因此ALK抑制劑克唑替尼在治療ROS1融合基因陽性的NSCLC中具有明顯療效[5,6]。ROS1融合基因為肺癌的個體化治療提供新的方案，明確ROS1融合基因在肺腺癌中的陽性率，了解陽性患者臨床病理特徵及推斷好發人群對臨床實踐具有重要的意義。
目前用於檢測肺癌ROS1融合基因方法主要包括熒光原位雜交（FISH）、逆轉錄-聚合酶鏈反應和免疫組織化學技術（IHC）。FISH檢測ROS1融合基因特異性高，但成本高、試劑昂貴、處理時間長、檢測結果判斷要求高水準的專業診斷技術、診斷主觀性強且不能鑒別ROS1融合基因的融合夥伴。逆轉錄-聚合酶鏈反應對組織中RNA的質量有較高要求，不能檢測新的未知的融合型，但其技術簡單快速準確，靈敏度高，適用於活檢組織等少量組織標本。IHC在病理實驗室普遍應用，成本低、簡便快速，但檢測成功與否取決於組織中ROS1融合蛋白的表達量和相應抗體的特異性、敏感性及評分方法，主觀性強。Boyle等[7]用FISH和IHC兩種方法重新檢測已被逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測的33例肺腺癌組織，其中6例ROS1融合基因陽性和27例ROS1融合基因陰性；結果顯示FISH檢測出6例陽性標本中5例陽性，27例ROS1融合基因陰性標本均是陰性，1例假陰性是因為該例ROS1融合夥伴是位於同一染色體的EZR基因，2個探針距離小，顯微鏡下分裂信號微小，易漏診；IHC使用抗體D4D6，當免疫組織化學染色組織學積分>100時，檢測出6例陽性標本中6例陽性，27例ROS1融合基因陰性均是陰性，但使用IHC法檢測需要嚴格的染色和評分方法。鑒於FISH和IHC兩種方法判斷結果時有一定的主觀性，我們採用RT-PCR法檢測369例肺腺癌患者的石蠟包埋切片ROS1融合基因表達情況並加以驗證，探討其可行性。文獻報道ROS1融合基因在NSCLC中的陽性率約為1.0%～3.4%，在EGFR/KRAS/ALK均陰性的人群中的發生率則可提高到5.7%[8]，病理類型主要是腺癌[9]。本組ROS1融合基因總陽性檢出率為4.3%，可能因為研究對象均是腺癌患者。結果提示，ROS1融合基因的分布在東西方人群中並沒有較大的差異。ROS1基因發生融合時丟失細胞外區域，保留跨膜和細胞內酪氨酸激酶區域，融合位點主要發生在ROS1基因的第32、34、35、36號外顯子；目前為止，在NSCLC中已發現至少有9種不同的ROS1融合基因包括FIG-ROS1、CD74-ROS1 SLC34A2-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1、LRIG3-ROS1、KDELR2-ROS1和CCDC6-ROS1，最常見的融合類型是CD74-ROS1[10,11,12]。本組顯示ROS1基因拼接外顯子12例發生在第34號外顯子，8例第32號外顯子，4例同時發生在第34和32號外顯子。9例ROS1融合基因類型是CD74-ROS1，6例是SDC4-ROS1，2例是SLC34A2-ROS1，表明ROS1融合基因的多樣性和複雜性。
對本組結果進行總體分析，不同臨床病理特徵的患者之間的ROS1融合基因陽性率並無明顯差異，這可能與ROS1融合基因陽性的例數較少有關。我們發現本組患者性別的差異並不明顯，ROS1融合基因多發於青年（5.1%）、不吸煙患者（4.4%），其比率高於年長（3.4%）、吸煙患者（3.9%）。進一步分析16例ROS1融合基因陽性患者的特徵構成比提示：患者平均年齡57.4歲，低於總體患者的平均年齡59.5歲，表明ROS1陽性更多見於年輕患者；非吸煙者14例，吸煙者2例，提示ROS1陽性更多見於非吸煙患者；高、中和低分化患者分別為1例、5例和10例，表明ROS1陽性多見於組織學低分化且高度惡性的肺腺癌患者。Bergethon等[9]分析了18例ROS1陽性患者的臨床資料，NSCLC中ROS1陽性患者與ALK陽性患者的臨床特徵有著相似性，ROS1陽性患者同樣具有患病年齡年輕化（平均年齡49.8歲），從未吸煙的晚期（臨床Ⅳ期）肺腺癌患者。本組研究結果基本上與文獻報道一致，即ROS1融合基因陽性多見於年輕、不吸煙、組織學低分化且高度惡性的肺腺癌患者[9,13]。
目前尚未檢索到ROS1融合基因與2011年國際肺癌研究學會/美國胸科學會/歐洲呼吸學會國際多學科的肺腺癌新分類標準中腺癌組織學亞型相關性的報道。我們發現ROS1融合基因在肺腺癌組織學亞型的差異無統計學意義。16例ROS1融合基因陽性肺腺癌按照2011年新分類：腺泡狀為主8例（8/16）、乳頭狀為主4例（4/16）、實性為主3例（3/16）及浸潤性黏液腺癌1例（1/16），含有腺泡狀成分12例（12/16）、乳頭狀成分9例（9/16）、實性成分6例（6/16）、微乳頭狀成分4例（4/16）、貼壁狀成分1例（1/16）及浸潤性黏液腺癌成分1例（1/16），14例（14/16）含有腺泡狀和/或乳頭狀成分，推測ROS1融合基因陽性多見於組織成分中腺泡狀和/或乳頭狀成分顯著的肺腺癌，有待進一步的研究證實。研究表明ROS1融合基因陽性的肺癌患者，一般不伴有EGFR基因突變、ALK融合基因等，但目前有不少研究發現ROS1融合基因可以與其他基因突變共存。Rimkunas等[10]報道9例ROS1融合基因陽性的患者中，有2例（2/9）患者伴隨EGFR（L858R）或EGFR（E746-A750del）突變；Go等[14]報道451例肺腺癌，有8例患者ROS1融合基因陽性，有1例（1/8）患者同時有EGFR（E746-A750del）突變。本組中EGFR野生型患者232例，突變型137例，其中3例ROS1陽性患者同時存在EGFR突變和ROS1融合基因，EGFR突變類型均為第21號外顯子點突變（21L858R），組織學亞型均為腺泡狀為主，這表明ROS1融合基因與其他基因突變/融合共存，尤其伴隨EGFR突變，並不是罕見事件。ROS1融合基因與EGFR突變共存的患者是否具有獨特的臨床病理特徵、治療方案及預後，有待進一步研究證實。
總之，我們認為肺腺癌患者中存在4.3%的ROS1融合基因，可以多位點融合。ROS1融合基因陽性多見於年輕、不吸煙、組織學低分化的肺腺癌患者，組織成分中腺泡狀和/或乳頭狀成分顯著。ROS1融合基因可以與EGFR突變共存，代表了一類新的肺腺癌分子亞型，可能成為繼EGFR及ALK之後肺腺癌治療的新靶點。
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