2017年1月CRISPR/Cas重大進展梳理

2017年1月31日/生物谷BIOON/--基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

接下來，小編列舉最近一段時間CRISPR基因編輯系統取得的重大進展，詳情如下所示。

1.Science子刊：利用CRISPR/Cas9修復源自罕見免疫缺陷病患者的造血幹細胞基因缺陷

doi:10.1126/scitranslmed.aah3480

2017年1月24日，清華大學譚旭研究組與美國俄亥俄州立大學董一洲研究組合作在《Cell Research》上發表了題為《A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in vivo》，在國際上首先研發出一種新型CRISPR/Cas9遞送系統，其能夠在體內遞送CRISPR/Cas9至肝臟，並在單鏈引導RNA（sgRNA)的引導下靶向切割外源或內源致病基因從而達到治療肝病的目的。該種新型遞送系統為CRISPR/Cas9這一強有力的基因編輯工具，在臨床上的實際應用開闢了新途徑。

基於脂質納米顆粒的核酸輸送系統已經在活體內輸送小RNA，如siRNA上表現出良好的效果。譚旭課題組與董一洲研究組合作研發了一種新型脂質納米顆粒系統，其可以包裹Cas9蛋白的mRNA以及單鏈引導RNA並在活體內有效的輸送至肝臟並進行表達，對特定致病基因進行切割。

為測試所研發的新型脂質納米顆粒系統的實際效果，研究組分別選取了以下一個外源性靶點和一個內源性靶點進行測試。選擇的外源性靶點是乙肝病毒（HBV）基因組。全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，而在中國更是一個嚴重的社會問題。乙肝病毒難以徹底清除的主要原因是其基因組以一種共價閉環DNA（covalently closed circular DNA或cccDNA)形式存在，而現有治療手段均無法觸及cccDNA；選擇的內源性靶點是前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9， PCSK9）是當前針對高膽固醇血症和其它心血管疾病藥物研發的重要靶點。就目前來看，針對PCSK9的藥物主要是抗體類藥物，需要長期多次服用，價格昂貴。上述二者均有希望通過編輯其基因序列而達到治療的目的，故研究組選取此二者為對象，測試這種新型的藥物遞送系統。

研究發現在細胞水平上，經這種新型脂質納米顆粒（LNP）包裹的Cas9/sgRNA，能夠有效的對細胞中HBVcccDNA和Pcsk9基因進行切割，並有效的降低HBV相關抗原的表達。動物實驗結果表明，這種新型脂質納米顆粒可以有效遞送Cas9/sgRNA輸送至肝臟進行表達，並且尾靜脈注射6小時後Cas9蛋白表達量達到最大，其後逐步降低，24小時後消失。在肝臟內，所遞送的Cas9/sgRNA能對內外源基因序列進行有效的特異性剪切，進而降低相關蛋白的表達量。一次注射能有效降低乙肝病毒表達量50％以上。國際審稿人認為這項工作是本領域激動人心的成果，對CRISPR/Cas9系統未來的臨床轉化研究有重要意義。

6.Nat Methods：開發出基於CRISPR/Cas9和單細胞RNA測序的CROP-seq方法 doi:10.1038/nmeth.4177

在一項新的研究中，來自奧地利科學院CeMM分子醫學研究中心的Christoph Bock及其團隊開發出一種新方法：將CRISPR集中篩選和按序篩選（arrayed screen）的優勢結合在一起。通過將CRISPR基因組編輯與單細胞RNA測序整合在一起，他們在單個實驗中研究上千個細胞，從而能夠平行地確定多種基因的調控影響。

Bock團隊成功地開發出一種採用了前沿的分子技術的優雅設計：論文第一作者Paul Datlinger構建出一種病毒載體，能夠讓CRISPRgRNA在單細胞測序實驗中可視化觀察，而最新的用於單細胞RNA測序的液滴方法足以高通量地分析單個細胞中上千種基因組編輯事件的影響。

通過創造性地將兩種極有前景的基因組學領域結合在一起，這種被稱作CROP-seq（CRISPR droplet sequencing, CRISPR液滴測序）的方法能夠在利用其它方法很難實現的規模和細節上高通量地分析基因調節。再者，隨著單細胞測序成本不斷下降，這種方法能夠產生首批人類基因組上2.3萬個基因中每個基因的調節影響的綜合圖譜。

7.Nat Commun：中科院遺傳發育所在小麥DNA-free基因組編輯方法研究中取得進展

doi:10.1038/ncomms14261

CRISPR/Cas9是目前應用最為廣泛的基因組編輯技術，已在作物基因功能研究以及品種改良中取得了巨大的成功。常規植物基因組編輯手段多通過農桿菌或基因槍的方法將CRISPR/Cas9 DNA表達框轉入並整合到植物基因組中，進而發揮功能對目的基因進行編輯。但是這些方法多存在許多不足，如較高的潛在脫靶效應、易出現嵌合體、需通過後代分離方可獲得無CRISPR/Cas9 DNA植物突變體。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組之前通過瞬時表達CRISPR/Cas9 的DNA或RNA的方式對小麥基因組編輯技術進行了改進，大大降低了外源DNA的整合幾率。但是，CRISPR/Cas9 DNA進入到細胞以後仍然有一定可能也會降解產生小的DNA片段整合到基因組中，而CRISPR/Cas9 RNA瞬時表達技術則對實驗操作具有較高要求，生產成本也較高。

此研究通過將CRISPR/Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白複合體（RNP），再利用基因槍法將CRISPR/Cas9 RNP轉入小麥細胞中，在兩個六倍體小麥品種中分別對兩個不同基因tagw2和tagasr7進行了定點編輯，成功地在小麥中建立了全程無外源DNA的基因組編輯體系。研究結果還表明相比於CRISPR/Cas9 的DNA或RNA瞬時表達體系，CRISPR/Cas9 的RNP可以明顯降低脫靶效應。這種DNA-free的基因組編輯方法具有精準、特異、簡單易行、成本低廉的優勢，並且成功避免了外源DNA片段整合到基因組中的潛在風險。這一利用CRISPR/Cas9 RNP實現小麥基因組編輯的方法有助於最大程度地減少監管，建立起精準、生物安全的新一代育種技術體系，加快作物基因組編輯育種產業化進程。

8.Cell：中科院解析VI型CRISPR-Cas系統C2c2-RNA複合物結構

doi:10.1016/j.cell.2016.12.031

1月12日，Cell 雜誌發表了中科院生物物理研究所王艷麗課題組關於Ⅵ型CRISPR-Cas系統的效應蛋白C2c2的結構研究。標題為「Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities」。該研究解析了Leptotrichia shahii（Lsh）細菌中C2c2與crRNA (CRISPR-RNA) 的二元複合物以及C2c2在自由狀態下的晶體結構，揭示了LshC2c2通過兩個獨立的活性結構域來發揮其兩種不同的RNA酶切活性，這為研究C2c2發揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。

2015年，一種全新的第二類CRISPR-Cas系統-Ⅵ型系統被發現，該系統中的效應蛋白被命名為C2c2。而後的研究進一步發現，Ⅵ型CRISPR-Cas系統是一種新型靶向RNA的CRISPR系統，而C2c2是一種以RNA為導向靶向和降解RNA的核酸內切酶，有望被開發作為RNA研究的工具，擴展CRISPR系統在基因編輯方面的運用。

王艷麗課題組通過深入的研究，解析了C2c2與crRNA的二元複合物的晶體結構以及C2c2蛋白的晶體結構，揭示了C2c2包含一個crRNA識別的葉片即REC葉片，和一個核酸酶葉片即NUC葉片。REC葉片包含NTD結構域（N-terminal domain）和Helical-1結構域，NUC葉片包含了兩個HEPN結構域、Helical-2結構域以及連接兩個HEPN結構域的連接結構域。負責切割前體crRNA和靶標 RNA的活性口袋分別位於Helical-1和HEPN結構域上。crRNA的結合會引起C2c2蛋白的構象變化，這種變化很可能會穩定crRNA的結合，進而對識別靶標RNA起著重要作用。該研究通過結構和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶標 RNA的分子機制，對認識細菌抵抗RNA病毒入侵的分子基礎具有十分重要的意義。同時也為改造CRISPR-C2c2系統，為其在基因編輯領域的運用提供了強有力的結構基礎，有助於加速對病毒感染引發的疾病的理解、治療和預防。

9.J Immunol Methods：俄科學家用基因剪刀找到抵禦白血病病毒抗體

doi:10.1016/j.jim.2016.09.006

圖片來自Thinkstock。

有研究發現，人體內本該攻擊某些病毒的Ｔ細胞表面存在能給病毒「帶路」並引發感染的受體。為堵住這一「內應通道」，俄羅斯研究人員利用CRISPR-Cas9「基因剪刀」技術，為T細胞找到了抵禦某種特定逆轉錄病毒的新抗體。這種方法或有助於治療白血病、艾滋病相關藥物的研發。

人類T細胞白血病病毒Ⅰ型（HTLV-1病毒）是一種逆轉錄病毒，能引發白血病，且與數種惡性腫瘤發病相關。這種病毒可攻入人體免疫細胞——Ｔ細胞內，進而分裂增殖實現感染。

俄免疫學研究所研究人員近期在國際學術期刊《免疫學方法》上報告說，他們推斷HTLV-1病毒是通過與Ｔ細胞表面特定受體結合後得以進入細胞內部的。因此，找到Ｔ細胞內編碼合成這種特定受體的基因，是堵住這一「內應通道」的關鍵。

CRISPR-Cas9以核糖核酸作為引導工具，能對基因進行剪切和編輯操作。研究人員用這一技術將T細胞中負責編碼合成該細胞表面各種受體的所有基因逐個敲除，或把T細胞內編碼合成受體的幾個基因以排列組合的方式剔除，由此培育出超過10萬種缺失不同受體的T細胞。

然後，他們再用HTLV-1病毒去感染這些被加工過的T細胞，如果發現某種T細胞未被感染，即可斷定這裡被敲掉的編碼基因合成的受體就是引狼入室的「內奸」。這時再針對該受體研製能與其結合并將病毒「關在門外」的抗體，從而阻斷感染。馬祖羅夫說，雖然這項工作也很龐雜，但與無明確目標的篩選相比要省事得多。

最終，研究人員發現，T細胞表面代號為CD82的受體會與HTLV-1病毒「牽手」。讓BF4單克隆抗體與CD82受體結合能夠阻止HTLV-1病毒藉助該受體潛入正常Ｔ細胞。（生物谷 Bioon.com）

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