窺探衰老：劉光慧等發展新型染色質成像工具

BioArt按：近期，「清除衰老細胞」（Killing old cells to stay young）被評選為2016年Science雜誌十大科學突破。那麼，如何能精準地判定機體或細胞是否處於衰老狀態呢？除了端粒縮短之外，是否還存在其它刻在人類基因組上的「年輪」? 2017年1月31日，Cell Research在線發表了來自中科院生物物理研究所劉光慧課題組和徐濤課題組，以及中科院動物研究所曲靜課題組合作完成的一項題為"Visualization of Aging-Associated Chromatin Alterations with an Engineered TALE System" 的研究成果。這篇文章發展了一種新型基因組DNA三維成像工具，利用此工具實現了對衰老伴隨的端粒縮短和著絲粒異染色質改變的精準成像。更為有趣的是，該研究發現了核仁區核糖體DNA拷貝數的減少可以作為人類衰老的新型標誌物。這些成果為在遺傳和表觀遺傳水平認識人類衰老的本質奠定了重要基礎。

論文解讀：

近年來，隨著CRISPR/Cas9和TALE等新型核酸結合蛋白的發現和應用使得對基因組特定序列的精準成像成為可能。然而，目前基於CRISPR/Cas9和TALE的成像系統尚存在一定的不足。CRISPR/Cas9系統的主要問題是由於其涉及多種蛋白和RNA元件，且Cas9蛋白分子量較大，因而該系統在哺乳動物細胞中瞬時表達存在難度，同時利用該系統成像時細胞核背景噪音也較高。TALE系統雖然理論上蛋白分子量小，並且可以直接結合DNA，但就目前發表的論文而言，尤其是利用人類細胞進行的基因組成像研究中，很少使用熒光原位雜交（FISH）這一「金標準」實驗對TALE的成像的精確度進行嚴格確證。

在該研究中，研究人員通過對傳統TALE介導的端粒、著絲粒和核仁區核糖體DNA等基因組重複序列的成像結果進行細緻分析，發現利用傳統的TALE標記基因組重複序列時會在細胞內產生異常的聚集斑塊（aggregates），且這些聚集斑塊多數情況下脫離了基因組上的DNA靶序列，因而極大地限制了TALE在染色質三維成像中的應用。研究團隊通過篩選一系列可提高細胞內蛋白溶解性的「助溶解多肽」，發現硫氧還蛋白（Thioredoxin）與TALE的融合表達（該融合蛋白稱為TTALE）能夠特異地清除TALE成像時伴生的聚集斑塊，從而最大程度地釋放TALE在染色質三維成像方面的效能。實驗結果表明，同Cas9相比，TTALE具有成像信噪比高、易於操作等優點，可廣泛應用於胚胎幹細胞、誘導性多能幹細胞、成體幹細胞（如間充質幹細胞和神經幹細胞等）、終末分化細胞（如神經元和血管平滑肌細胞）、腫瘤細胞以及卵細胞等多種人類細胞類型。此外，利用該工具，研究者們首次實現了對28S核糖體DNA的活細胞標記，並揭示28S核糖體DNA主要分布於核仁區的外周，這將為理解核糖體DNA和核仁在多種生命過程中的功能提供重要的線索和研究工具。

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圖1：利用TTALE成像系統實時觀測HeLa細胞有絲分裂過程中端粒和著絲粒的動態變化（A）；TTALE介導的28S核糖體DNA在細胞核仁區的精準成像（B）。

人類衰老和許多衰老相關的疾病都伴隨著染色質結構的改變或異常，因此探索染色質結構的動態變化對於深入理解衰老及衰老性疾病的機制具有重要的意義。基因組重複序列是隱含在人類基因組中的「暗物質」，通常被包裹在緻密的異染質中，並且被認為是無用的「垃圾序列」。由於研究手段的限制，在現有的大多數基因組信息分析中，這些「垃圾序列」往往會被主觀地「忽略」掉。人們所熟知的端粒其實也是一種基因組重複序列，而端粒的縮短已經成為衰老研究領域中為數不多的重要分子標記物之一。儘管如此，對於衰老是否伴隨更為廣泛的基因組重複序列的改變，目前人們還知之甚少。利用TTALE成像系統，研究團隊發現核仁區核糖體DNA拷貝數的減少可能是人類衰老的生物鐘之一。人類衰老所伴隨的核仁區核糖體DNA拷貝數的減少同端粒的縮短同樣顯著，並且可以方便地在老年人的外周血中檢測到，因此可以用作評價人類衰老進程的新型分子標誌物。此外，研究人員也利用TTALE系統在培養皿中觀測到了細胞衰老伴隨的端粒縮短和著絲粒異染色質失序等基因組結構的變化，並且首次在體內單細胞水平觀察到了端粒酶缺失小鼠的端粒加速縮短現象。

這些發現為揭示人類染色質三維結構及其動態變化在衰老和疾病中的作用提供了強有力的研究工具。此外，全新人類衰老分子標誌物的確立也將為衰老的基礎和轉化研究提供助力。

圖2：TTALE成像系統可用於精準觀測衰老伴隨的端粒縮短、核仁區核糖體DNA拷貝數的減少，以及著絲粒異染色質去緻密化等染色質結構的改變。

劉光慧研究員簡介：

劉光慧，中科院生物物理所研究員，中國科學院大學崗位教授，博士生導師，國家自然科學基金委傑出青年基金獲得者，幹細胞國家重大科學研究計劃（973）項目首席科學家，Protein & Cell雜誌副主編

一，學習和工作經歷

1997-2002，北京大學醫學部，藥理學學士；2002-2007，中國科學院生物物理研究所，理學博士；2007-2009，美國斯克利普斯（Scripps）研究所，Research associate；2009-2011，美國索爾克（Salk）生物學研究所，Research associate；2011至今，中科院生物物理所，研究員、博士生導師；2012，國家青年千人計劃

二，研究方向

1. 基於多能幹細胞的人類疾病模型和精準治療體系

2. 人類健康長壽的（表觀）遺傳信息解碼

3. 新型基因編輯技術的發展和應用

三，代表性科研成果

（1）利用誘導多能幹細胞（iPSC）技術闡明兒童早衰症患者血管細胞退行的分子機理（Nature，2011）

（2）利用HDAdV介導的基因編輯技術實現兒童早衰症患者iPSC 中致病突變基因的靶向矯正（Cell Stem Cell，2011）

（3）利用全基因組測序證明HDAdV和TALEN兩種基因靶向矯正工具的安全性，並發展高效的基因編輯/矯正工具telHDAdV（Cell Stem Cell，2014）

（4）利用基因編輯技術建立人成年早衰症幹細胞模型，揭示異染色質高級結構失序在人類衰老中的驅動作用（Science，2015）

（5）揭示長壽基因SIRT6 調節人幹細胞衰老和穩態的新機制（Cell Res，2016）

（6）利用基因編輯技術建立帕金森病的人類多能幹細胞模型，揭示帕金森病的神經幹細胞病變，發現干預帕金森病神經幹細胞表型的候選化合物（Nature，2012）

（7）產生范可尼貧血症iPSC，實現其致病基因靶向矯正，篩得改善范可尼貧血症造血前體細胞活力的候選化合物（Nat Commun，2014）

（8）利用基因編輯技術發展人類神經膠質母細胞瘤幹細胞模型，篩得可精準殺傷PTEN缺失膠質母細胞瘤幹細胞的候選化合物（Nat Commun，2015）

（9）利用兒童早衰症幹細胞研究體系，揭示FDA批准的NRF2激動劑奧替普拉可抑制兒童早衰症幹細胞的加速衰老（Cell，2016）

（10）發展精準基因組成像工具TTALE，用於觀測衰老伴隨的染色質結構改變；揭示核仁區核糖體DNA重複序列的減損可作為新型人類衰老標記物（Cell Res，2017）

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