八面玲瓏的長非編碼RNA

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認識一下長非編碼RNA

定義

非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)指不翻譯成多肽的RNA。按照長度不同，短於200nt的歸為小非編碼RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，長於200nt的歸為長非編碼RNA (long ncRNAs，lncRNAs)。

分類

根據染色體上與編碼基因的相對位置將lncRNA分為反義型(antisense lncRNAs)、內含子型(intronic lncRNAs)、反向型(divergent lncRNAs)、基因間型(intergenic lncRNAs)、啟動子上游型(promoter upstream lncRNAs)、啟動子型(promoter-associated lncRNAs)、轉錄起始位點型(transcription start site-associated lncRNAs) [1, 2] (圖1)。

圖1. 根據染色體上與編碼基因的相對位置對ncRNA進行分類。

lncRNAs作用範圍廣泛，機制非常複雜，這裡從基因調控的角度重點講一講。為了方便大家的理解，咱們來看看lncRNA的特點。簡單講，lncRNA的本質是RNA，是由核苷酸組成的長鏈，有以下幾個優勢：(1)可以輕鬆的與同源DNA序列(轉錄lncRNA的基因以及序列相似的基因)結合；(2)可以輕鬆的與同源RNA序列結合；(3)其絲帶般的特點可以摺疊成複雜的二級結構，輕鬆與多種蛋白質結合。也就是說，lncRNA情商極高，與上層領導(DNA)關係曖昧，與同事(RNA)關係很鐵，與下屬(蛋白質)關係緊密。這樣八面玲瓏的lncRNA那肯定是相當吃得開啊。

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lncRNA參與轉錄前調控

顧名思義，轉錄前調控就是對轉錄事件發生之前的準備階段進行調控，主要指染色質開放或關閉狀態的調控——想要使原來不轉錄的基因開啟轉錄，就需要染色質從關閉狀態轉換為開放狀態；想要使原來轉錄的基因不再轉錄，就需要染色質從開放狀態轉換為關閉狀態。染色質的狀態由表觀修飾因子決定：富含H3K4me3、H3K36me3及組蛋白乙醯化等激活型組蛋白修飾的為開放狀態；富含H3K9me3、H3K27me3、H4K20me3及DNA甲基化等抑制型組蛋白修飾的為關閉狀態。表觀修飾是由表觀因子催化建立或擦除的，表觀因子的本質是蛋白，那麼問題來了，蛋白質結構是固定的，但基因組DNA序列變幻莫測，那究竟怎麼實現染色質狀態的精確調控呢？這時候就到八面玲瓏的lncRNA出場的時候了——lncRNA以其中一部分區域與DNA結合，然後其他部分摺疊成高級結構，與表觀因子結合，這樣就輕鬆地牽了線，搭了橋。

2.1lncRNA調控組蛋白修飾

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Xist與順式H3K27me3建立

X染色體失活(Xchromosome inactivation，Xi)是哺乳動物雌性個體的一種劑量補償效應[3]，通過抑制型表觀修飾鎖住一條X染色體。Xist(X染色體失活特異轉錄本，X chromosome inactivation specific transcript)是X染色體失活中心內鑒定出的第一個Xi相關基因，也是最關鍵的Xi調控基因。Xist能順式(in cis)包裹X染色體，並募集異染色質修飾蛋白PRC2等建立H3K27me3，引起轉錄沉默，最終導致整條染色體失活[4]，該過程有lncRNARepA(Xist基因5』端的腺嘌呤重複區轉錄本)的協同參與(圖2)[5]。

圖2.Xist與RepA協同包裹X染色體並募集PRC2建立H3K27me3引起X染色體失活。

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Bxd與順式H3K4me3建立

果蠅Hox基因簇內研究的首個lncRNA是Bxd(似雙胸轉錄本，Bithoraxoid)，其基因座是位於UBx基因(超級雙胸基因，Ultrabithorax)和Abd-A基因之間的調控序列——ubx-TRE(Ubx基因相關順式三胸複合體反應元件，Ubx cis-regulatory trithorax response elements)。Sanchez-Elsner對果蠅成蟲盤細胞及S2細胞的研究表明，Bxd能與ubx-TRE結合并募集TrxG成員組蛋白甲基轉移酶ASH1，激活Ubx轉錄[6] (圖3)。

圖3.Bxd與ubx-TRE結合并募集ASH1激活Ubx轉錄。

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HOTAIR與反式H3K27me3建立及H3K4me3擦除

HOTAIR是目前研究較清楚的參與人Hox基因簇調控的關鍵基因之一。HOTAIR位於Hoxc11和Hoxc12之間，通過與兩個關鍵的組蛋白修飾複合體相互作用，反式(in trans)調控HoxD基因簇的表達：催化H3K27me3建立的PRC2複合體[7]，及催化H3K4me2/3擦除的LSD1-CoREST-REST複合體(組蛋白特異性去甲基化酶1 - RE1結構域轉錄抑制因子共抑制因子1 - RE1結構域轉錄抑制因子複合體，lysine-specific demethylase1-RE1-Silencing Transcription factor corepressor 1-RE1-Silencing Transcription factor complex，LSD1-CoREST-REST)[8](圖4)。

圖4.HOTAIR通過與兩個組蛋白修飾複合體相互作用反式調控HoxD基因簇的表達。

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HOTTIP與順式H3K4me3建立

HOTTIP(HoxA基因簇末端轉錄本，HoxA transcript at the distal tip)對HoxA基因簇5』區域基因(Hoxa13至Hoxa6)的表達具有調控功能。2011年，Wang, K. C.等[9]的研究表明，HOTTIP通過WDR5(銜接蛋白WD重複序列蛋白5，WD repeat-containing protein 5)募集MLL(混合型白血病相關蛋白複合體，Mixed lineage leukemia)至HoxA基因簇5』區域，催化建立激活型染色質修飾H3K4me3，順式激活Hoxa11和Hoxa13等基因的表達(圖5)。

圖5.人HOTTIP通過WDR5募集MLL至HoxA基因簇5』區域，催化建立H3K4me3，順式激活基因表達。

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Mira與順式H3K4me3建立

Bertani等以視黃酸(Retinoic acid，RA)處理的小鼠胚胎幹細胞系(mES)為實驗材料，通過RNA-ChIP(RNA-染色體免疫沉澱，RNA-chromatin immunoprecipitation)等技術研究發現，Mira能與其基因座形成DNA/RNA雜合體，並募集TrxG複合體成員MLL1，催化建立H3K4me3，激活相鄰基因Hoxa6與Hoxa7的表達，導致mES向生殖系分化[10](圖6)。

圖6.Mira通過募集MLL激活相鄰Hoxa6與Hoxa7基因的表達。

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Evf2與組蛋白去乙醯化

DLX5和DLX6間的極端保守區(ultraconserved region)含2個Dlx5/6相關增強子(Dlx5/6-Enhencer，Dlx5/6-E，Dlx5/6-EI；Dlx5/6-EII)。Evf2是Dlx5/6-E相關的轉錄本。利用熒光素酶報告系統，Feng等發現在體外Dlx2存在條件下，Evf2能增強含Dlx5/6-E的SV40等啟動子的轉錄活性，並且是劑量依賴的，但DLX2本身沒有這種功能，表明Evf2可能作為DLX2的共激活因子(co-activator)增強Dlx5/6增強子活性[11]。而Evf2在低濃度條件下則能通過其Dlx6反義特性順式抑制Dlx6轉錄，通過募集MECP2，進而募集HDAC，使組蛋白去乙醯化，抑制Dlx5基因的轉錄(圖7)。

圖7：Evf2在高濃度條件下作為DLX2的共激活因子，增強Dlx5/6增強子活性，激活Dlx5及Dlx6轉錄。Evf2在低濃度條件下能通過其Dlx6反義特性順式抑制Dlx6轉錄，通過募集MECP2，進而募集HDAC，抑制Dlx5。

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asOct4-pg5與反式H3K27me3及H3K9me3的建立

Oct4的表達受到asOct4-pg5的調控。asOct4-pg5是Oct4假基因5(Oct4 pseudogene 5，Oct4-pg5)的反義無poly(A)結構lncRNA。asOct4-pg5能募集EZH2及G9a等組蛋白甲基轉移酶結合到Oct4及Oct4-pg5啟動子區，建立H3K27me3、H3K9me3等抑制型染色質修飾，進而抑制Oct4及Oct4-pg5的轉錄；而當asOct4-pg5與PURA(富嘌呤元件結合蛋白A，purine rich element binding protein A)及NCL(核仁蛋白，nucleolin)結合後會失去募集EZH2及G9a的能力，抑制功能消失[12] (圖8)。

圖8.asOct4-pg5與Oct4表達調控。A：存在一種Oct4-pg5反義的無poly(A)結構的lncRNA——asOct4-pg5。B：asOct4-pg5能募集EZH2及G9a等組蛋白甲基轉移酶結合到Oct4 (或Oct4-pg5，圖中未顯示)啟動子區，建立H3K27me3、H3K9me3等異染色質修飾，進而抑制Oct4的轉錄。C：當asOct4-pg5與PURA及NCL結合後會失去募集EZH2及G9a的能力。

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ANRIL (p15AS)與H3K4me3、H3K9me3及H3K27me3

Hansen等發現了INK4基因座反義非編碼RNA，命名為ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus)，Yu等也發現了INK4基因座反義非編碼RNA，命名為p15AS[13]，為方便起見統一命名為ANRIL。RACE分析表明ANRIL並非單一轉錄本，有很多剪接形式存在，甚至有環狀的ANRIL(circular ANRIL，cANRIL)[14]。研究表明，ANRIL能順式(主要模式)及反式作用於INK4β基因的啟動子及外顯子1，導致H3K4me3水平降低，H3K9me3水平升高，促進異染色質形成，引起INK4β轉錄沉默[13] (圖9)。

以人前列腺癌細胞系PC-3為材料，Yap等發現RNA polII轉錄的新生的ANRIL能與PRC1組分CBX7(Chromo結構域蛋白同系物7，Chromobox protein homolog 7)結合，促進異染色質形成，同時形成的ANRIL-CBX7複合體能解除CBX7與H3K27me3的結合，使轉錄抑制處於一種動態變化狀態[15] (圖9)。Kotake等的研究表明，INK4β/INK4α/ARF基因簇H3K27me3等抑制型修飾的建立，是ANRIL募集PRC2實現的，其中ANRIL與亞基SUZ12結合，順式抑制INK4β的轉錄[16](圖9)。

圖9.新生的ANRIL能與CBX7結合，促進異染色質形成，同時形成的ANRIL-CBX7複合體能解除CBX7與H3K27me3的結合，使轉錄抑制處於一種動態變化狀態。ANRIL募集PRC2，使INK4β/INK4α/ARF基因簇建立H3K27me3等抑制型修飾。ANRIL與SUZ12結合，順式抑制INK4β的轉錄。

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DBE-T與順式H3K36me2建立

面肩胛臂肌肉萎縮(facioscapulohumeral muscular dystrophy，FSHD)是一種常染色體顯性遺傳疾病，是由於D4Z4重複序列拷貝數降低導致的。FSHD病人由於D4Z4重複序列拷貝數降低，導致DBE-T(D4Z4重複序列結合元件轉錄本，D4Z4 repeat binding element transcript)特異性轉錄[17]。Cabianca等的研究表明，D4Z4重複序列的丟失，導致PcG蛋白不能與該區域結合，PRC2建立的H3K27me3及PRC1建立的抑制型修飾H2AK119ub1(組蛋白H2A第119位賴氨酸殘基單泛素化，histone H2A lysine 119 monoubiquitination)丟失[17, 18]；同時，DBE-T是一種染色質定位的lncRNA，能順式的通過募集TrxG蛋白成員Ash1L至4號染色體長臂第35區(4q35)，催化建立激活型修飾H3K36me2(組蛋白H3第36位賴氨酸殘基二甲基化，histone H3 lysine 36 dimethylation)，導致染色質重塑，激活4q35區域基因的轉錄，最終導致FSHD疾病的發生[17](圖10)。

圖10.DBE-T能順式募集Ash1L至4q35區，催化建立激活型染色質修飾H3K36me2，激活4q35區基因轉錄，最終導致FSHD疾病的發生。

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NeST與反式H3K4me3建立

NeST(nettoie Salmonella pas Theiler』s [cleanupSalmonella not Theiler』s])是發現的首個與免疫反應相關的lncRNA。在小鼠中，其基因座與γ干擾素基因(Interferon-γ，Infg)毗鄰。NeST最初被認為是泰勒病毒(Theiler』svirus)易感位點。NeST定位於細胞核內，屬於增強子型lncRNA。在活化的CD8+T細胞中，NeST通過與銜接蛋白WDR5結合，募集MLL，反式激活Ifng (圖11)，從而提高了抗腸炎沙門菌亞屬鼠傷寒病毒(Salmonella entericaTyphimurium)的能力[19]。

圖11. 在活化的CD8+T細胞中，NeST通過與銜接蛋白WDR5結合，募集MLL反式激活Infg。

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ncRNA-CCND1與順式組蛋白乙醯化

研究發現，在受到電離輻射後，CCND1啟動子及5』調控區轉錄形成多種ncRNA-CCND1(細胞周期蛋白D1的5』調控區相關非編碼轉錄本，ncRNAs transcribed from the cyclin D1 5』 regulated region)，這些含寡聚GGUG的lncRNA能結合并激活TLS(脂肪瘤內異位蛋白，translocated in liposarcoma)，進而順式募集TLS至CCND1啟動子的CRE區(CREB調控元件，CREBregulate element)，抑制CBP、EP300等的組蛋白乙醯化轉移酶(histoneacetylation transferase，HAT)活性。由於CCND1的轉錄依賴H3K9/K14ac(組蛋白H3第9位及第14位賴氨酸殘基乙醯化，histone 3 lysine 9/14 acetylation)，因此CBP/EP300 HAT活性的抑制直接導致CCND1沉默[20] (圖12)。

圖12.CCND1啟動子及5』調控區轉錄形成多種ncRNA-CCND1，這些含寡聚GGUG的lncRNA一方面能結合并激活TLS，另一方面則順式募集TLS至CCND1啟動子的CRE區，抑制CBP、EP300等的HAT活性，導致CCND1沉默。

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PTENpg1 uasRNA α及PTENpg1 asRNA α與異染色質化

PTEN(磷酸酶與張力蛋白同源蛋白，phosphatase and tensin homolog)基因是一種腫瘤抑制基因[21]。研究表明，PTEN的假基因1(PTEN pseudogene，PTENpg1)[22]以及PTENpg1的反義RNA(PTENpg1 antisense RNA，PTENpg1 asRNA)[23]均屬於lncRNA基因，參與了PTEN的表達調控。

PTENpg1 asRNA有三種：未剪切的PTENpg1 uasRNA α、剪切的PTENpg1 asRNA α及PTENpg1 asRNA β。PTENpg1 uasRNA α及PTENpg1 asRNA α能反式作用於PTEN啟動子區，募集DNMT3a及EZH2導致PTEN啟動子區異染色質化，從而在轉錄前水平抑制PTEN的表達。

PTENpg1 asRNA β則能與PTENpg1相互結合，增加PTENpg1的穩定性並促進其出核進入胞質，同時，PTENpg1可作為ceRNA，吸附針對PTEN的miRNA，從而削弱了miRNA對PTEN的負調控，增強了PTEN mRNA的穩定性，在轉錄後水平促進PTEN的表達[23] (圖13)。

圖13.PTENpg1 uasRNA α及PTENpg1 asRNA α能反式作用於PTEN啟動子區，募集DNMT3a及EZH2導致PTEN啟動子區異染色質化，從而在轉錄前水平抑制PTEN的表達；PTENpg1 asRNA β則能與PTENpg1相互結合，增加PTENpg1的穩定性並促進其出核進入胞質，同時能增強PTENpg1吸附針對PTEN的miRNA的能力，從而削弱了miRNA對PTEN的負調控，增強了PTEN mRNA的穩定性，在轉錄後水平促進PTEN的表達。

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Kcnq1ot1與Kcnq1基因座沉默

基因印記是一種表觀遺傳機制，是一種二倍體細胞中父母親本特異的基因表達模式。為什麼哺乳動物放棄二倍體優勢而進化出印記沉默系統是自印記現象發現以來一直困擾生物學者們的難題之一。

印記基因一般成簇存在，印記基因簇受印記調控元件(Imprinting control element，ICE)的調控[26]。印記基因簇的共同特徵是都含有配子差異性DNA甲基化區域(Differentially DNA-methylated region，DMR)。目前定義了兩種印記基因簇：Igf2r、Kcnq1、Gnas、Pws等印記基因簇的DMR在卵子成熟過程中獲得母源甲基化印記，這種含母源DNA甲基化印記DMR的印記基因簇為I型印記基因簇；Igf2、Dlk1、Rasgrf1等印記基因簇在精子發生過程中獲得父源甲基化印記，這種含父源DNA甲基化印記DMR的印記基因簇為II型印記基因簇。

印記基因簇中至少含1個lncRNA [27, 28]，但這些lncRNA的調控功能還需要進一步的研究。目前認為I型印記基因簇的印記狀態的穩定與lncRNA的表達有關。Pandey等證明Kcnq1ot1能募集G9a及PRC2，催化建立H3K27me3及H3K9me3等異染色質修飾，導致Kcnq1基因座沉默[29]；Faizaan等發現Kcnq1ot1能與DNMT1形成複合體，催化建立DNA甲基化，導致Kcnq1基因座沉默[30](圖14)。

圖14.Kcnq1ot1能募集G9a及PRC2，催化建立H3K27me3及H3K9me3等異染色質修飾，還能募集DNMT1，催化建立DNA甲基化，導致Kcnq1基因座沉默。

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pRNA與rDNA異染色質化

在mES中，pRNA前體IGS-rRNA(intergenic spacer rRNA)抑制TTF-1(RNA聚合酶I轉錄終止因子1，RNA polymerase I transcription termination factor 1)與TIP5(TTF-1互作蛋白5，TTF1-interacting protein 5)的結合，保護rDNA不被異染色質化，而在mES分化後，IGS-rRNA被加工成成熟的pRNA，pRNA介導TTF-1與TIP5形成複合體，進而將其募集至rDNA啟動子區域，造成DNMT家族及PARP1的富集，最終導致rDNA異染色質化[24, 25](圖15)。

圖15.mES分化後成熟的pRNA通過介導TTF-1與TIP5形成複合體進而促進rDNA異染色質化。

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lncRNA與裂殖酵母臂間區異染色質化

在裂殖酵母，臂間區外側重複序列的轉錄及其下游過程與異染色質建立相關[31]。裂殖酵母異染色質建立的機制有2種假說：(1) siRNA機制，即RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RNA PolII)先起始轉錄產生lncRNA，然後RDRC(RNA指導的RNA聚合酶複合體，RNA-directed RNA polymerase complex)識別並結合正在轉錄的lncRNA，合成雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，同時RDRC的Cid12亞基催化dsRNA末端多聚腺苷酸化，進而被Dicer識別結合并加工成siRNA，組成RITS，其Argonaute(Ago1)亞基結合siRNA並與正在轉錄的重複序列lncRNA結合，其含chromo結構域的Chp1亞基則與H3K9me2/3結合，募集組蛋白甲基轉移酶Clr4及異染色質結合蛋白Swi6等，實現異染色質化(圖16)；(2)組蛋白修飾H3K9me2/3直接募集RITS及RDRC至正在轉錄的異染色質lncRNA上，不涉及siRNA。

圖16.裂殖酵母異染色質形成機制。

2.2lncRNA調控DNA甲基化修飾

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Tsix與DNA甲基化

Tsix(跨越Xist全長的反向非編碼RNA)是最主要的Xist負調控基因。Tsix能結合於Xist基因5』端兩CTCF(CCCTC結合因子，CCCTC-binding factor)結合域之間，募集抑制型表觀因子(如CTCF、DNMT、EED[32])，催化DNA甲基化(主要)及H3K9me3 (次要)的建立[33]。Jpx則通過結合CTCF抑制了CTCF對Xist的轉錄抑制，從而起到激活Xist轉錄的作用[34] (圖17)。

圖17.Tsix通過募集CTCF等使Xist啟動子區甲基化而抑制Xist轉錄，Jpx則通過結合CTCF抑制了CTCF對Xist的轉錄抑制。

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Khps1a與DNA甲基化

Khps1a(鞘氨醇激酶1反義轉錄本a，sphingosine kinase-1 antisense type a)指導鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase-1，Sphk1)的組織依賴型差異甲基化區(tissue-dependent differentially methylated region，T-DMR)去甲基化[35]。大鼠腎細胞系NRK的Sphk1 T-DMR區是全甲基化的，但過表達Khps1a後T-DMR區顯著去甲基化，且有2個CC(A/T)GG位點發生甲基化(CmC(A/T)GG)，具體機制尚不明確(圖18)。

圖18.Khps1a以某種未知機制參與了Sphk1的T-DMR區去甲基化.

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Dum與DNA甲基化

2015年Wang等在骨骼肌成肌細胞中鑒定出lncRNADum(發育多能性相關基因2上游肌相關lncRNA，Developmental pluripotency-associated 2upstream binding muscle lncRNA)。Dum能順式募集DNMT1、DNMT3A、DNMT3B等至鄰近基因Dppa2的啟動子區，並造成該區域甲基化沉默，從而抑制Dppa2的表達，導致骨骼肌成肌細胞向肌細胞分化[36](圖19)。

圖19.Dum能順式募集DNMT1、DNMT3A、DNMT3B等至鄰近基因Dppa2的啟動子區，並造成該區域甲基化沉默，從而抑制Dppa2的表達，導致骨骼肌成肌細胞向肌細胞分化。圖片引自Wang et. al, 2015.

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lincRNA參與轉錄調控

轉錄調控是指對轉錄過程的調控。咱們這裡討論的是RNA polII參與的II類啟動子的轉錄。轉錄過程分為起始(Initiation)、延伸(Elongation)和終止(Termination)3個過程。

轉錄起始過程是RNA polII在核心轉錄因子(TBP、TFIIB、TFIIE、TFIIF等)幫助下與核心啟動子結合，DNA局部解旋，合成9nt的RNA，由於RNApolII的C末端結構域(C terminal domain，CTD)磷酸化水平很低，因此轉錄暫停。

轉錄延伸過程是結合於增強子序列的轉錄因子(Transcription factors，TFs)使RNApolII的CTD高度磷酸化，轉錄過程迅速延伸(磷酸化水平決定延伸速度)。

轉錄終止過程是polyA信號位點AATAAA(或ATTAAA)被轉錄為AAUAAA(或AUUAAA)的RNA序列後，延伸複合體裡面的轉錄終止因子CSTF(切割刺激因子，Cleavage stimulation factor)和CPSF(切割及多聚腺苷酸化特異因子，Cleavage and polyadenylation specificity factor)迅速與AAUAAA(或AUUAAA)結合，並在其之後11-50nt處切斷RNA，然後催化末端加上一串的A(大家可以觀察一下mRNA序列，一般在AATAAA(或ATTAAA)之後11-50nt後出現一連串的A)。RNA被切斷後轉錄活性下降，再加上polyA信號位點AATAAA(或ATTAAA)之後的序列富含T或GT，很容易導致延伸複合體解散(圖20)。

圖20. RNA polII介導的轉錄過程。

只要涉及蛋白質與DNA的互作，lncRNA就有機可乘，因此在轉錄過程的調控中，lncRNA可以：(1)通過結合增強子控制TFs與增強子的互作從而調控增強子活性；(2)通過轉錄事件抑制RNA polII複合體與啟動子結合從而實現轉錄干擾；(3)因其與DNA很像，可作為誘餌捕獲TFs，從而控制轉錄因子的活性。

3.1lncRNA的增強子活性

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Xite與DXPas34以增強子活性順式調控Tsix的表達

小衛星序列DXPas34是Tsix啟動子的增強子[37]。DXPas34基因是雙向轉錄的，在小鼠雌性ES細胞Xi發生初期，DXPas34基因雙向轉錄產生Dxpas-f和Dxpas-r，促進Tsix表達；Xi完成後，DXPas34基因單向轉錄產生Dxpas-r，通過轉錄干擾(transcription interference)使Tsix沉默[38] (圖20)。Xite(Xi相關基因間轉錄元件，X-inactivation intergenic transcription element)也是Tsix啟動子的增強子(圖21)，敲除Xite後Tsix轉錄下調，Xi輕微失衡[39]。

圖21.Xite與DXPas34以增強子活性順式調控Tsix的表達。

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ncRNA-activiting的增強子模型

2010年De Santa等鑒定出3216個lincRNA，其中有2236個(69%)位於增強子內[40]。Orom等在人細胞系中鑒定出了一系列lincRNA，通過siRNA干擾實驗證明ncRNA-a7(ncRNA-activiting)對於Snai1的轉錄激活是必需的，用熒光素酶報告系統證明，ncRNA-a7作用依賴全長ncRNA-a7轉錄，且不受位置效應及方向性的限制，符合增強子的特徵(又如ncRNA-a3與Tal1)[41, 42]。2013年Lai等通過3C技術證明了ncRNA-a基因座與靶基因間DNA環的存在，同時，通過干擾參與轉錄激活的因子，Lai等證明ncRNA-a的增強子活性是由轉錄共激活複合體Mediator介導的[43]：MED1、MED12等亞基介導了ncRNA-a與靶基因啟動子區的結合，而CDK8亞基能催化激活型修飾H3S10ph(組蛋白H3第10位絲氨酸殘基磷酸化，histone H3 serine 10 phosphorylation)的建立，進而促進轉錄激活(圖22)。

圖22.ncRNA-a7以增強子活性促進Snail轉錄，其中Mediator作為媒介是已知的。

3.2

lncRNA調控絕緣子功能

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LINoCR抑制下游絕緣子活性

Lefevre等的研究表明，LINoCR(脂多糖誘導的非編碼RNA，lipopolysaccharide inducible non-coding RNA)在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導雞溶菌酶(Lysozyme，LYZ)表達的過程中，起到關鍵作用[44]。正常情況下，LYZ上游絕緣子結合CTCF，進而募集cohesin蛋白，抑制增強子的功能，LYZ處於沉默狀態；LPS誘導後，LINoCR轉錄，導致絕緣子不再與CTCF結合，解除了絕緣子對增強子的抑制作用，激活LYZ的表達[44] (圖23)。

圖23.正常情況下，LYZ上游絕緣子結合CTCF，抑制增強子的功能，LYZ處於沉默狀態；LPS誘導後，LINoCR轉錄，導致絕緣子不再與CTCF結合，解除了絕緣子對增強子的抑制作用，激活LYZ的表達。

3.3

lncRNA的轉錄干擾功能

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Dxpas-r干擾Tsix的轉錄

上文提到，DXPas34基因單向轉錄產生Dxpas-r，通過轉錄干擾使Tsix沉默[38] (圖21)。

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Srg1干擾Ser3的轉錄

Martens等的研究表明，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的SER3基因[絲氨酸(Serine，Ser)生物合成相關3-磷酸甘油酸脫氫酶，3-phosphoglycerate dehydrogenase in the biosynthesis of serine]的轉錄受到lncRNASRG1(SER3調控基因1，SER3 regulatory gene 1)的調控[45, 46]。Ser豐富的情況下，Ser與Ser依賴的轉錄因子Cha4結合，Ser-Cha4能與SRG1啟動子結合，募集SAGA(Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase)及SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fer-mentable)，參與酵母交配型轉換(mating type switching)及調控啟動蔗糖發酵過程的轉化酶SUC2等轉錄共激活因子，激活SRG1轉錄，轉錄延伸至下游的SER3基因座[46]，轉錄延伸複合體成分Spt2造成SRG1啟動子區核小體沉積，使RNA polII不能與SER3啟動子結合，造成轉錄干擾[47] (圖24)。

圖24.Ser豐富的情況下，Ser-Cha4與SRG1啟動子結合，募集SAGA及SWI/SNF等轉錄共激活因子，激活SRG1轉錄，轉錄延伸至下游的SER3基因座，轉錄延伸複合體成分Spt2造成SRG1啟動子區核小體沉積，使RNA polII不能與SER3啟動子結合，造成轉錄干擾。

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Pwr1干擾Icr1的轉錄；Icr1干擾Fol11的轉錄

Fol11是酵母菌(yeast)適應環境變化的關鍵基因之一，Bumgarner等的研究表明，lncRNAPwr1及lncRNAIcr1參與了Fol11的轉錄調控[48]。位於Pwr1與Fol11之間的調控區是Fol11的關鍵調控區，含有組蛋白去乙醯化酶RPD3L、轉錄激活因子Flo8、轉錄抑制因子Sfl1的結合位點。當RPD3L與調控區結合時，引起包括Sfl1結合位點在內的局部染色質固縮，結果Flo8與調控區結合，激活Pwr1，Pwr1轉錄導致其反義的Icr1沉默，同時Flo8激活Fol11轉錄；當RPD3L與調控區脫離時，Sfl1與調控區結合，抑制Pwr1，Icr1轉錄，轉錄延伸至Fol11啟動子區，造成轉錄干擾[48] (圖25)。

圖25.當RPD3L與調控區結合時，引起包括Sfl1結合位點在內的局部染色質固縮，結果Flo8與調控區結合，激活PWR1，PWR1轉錄導致其反義的ICR1沉默，同時Flo8激活FOL11轉錄；當RPD3L與調控區脫離時，Sfl1與調控區結合，抑制PWR1，ICR1轉錄，轉錄延伸至FOL11啟動子區，造成轉錄干擾。

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DHFRtinc干擾DHFR的轉錄

人DHFR基因(二氫葉酸還原酶，dihydrofolate reductase)啟動子上游存在一個弱啟動子[49]，弱啟動子的轉錄產物是一種lncRNA(筆者命名為DHFR transcription interferencing ncRNA，DHFRtinc)，延伸至DHFR的第二內含子[50]。在快速生長的細胞中，DHFRtinc不轉錄，DHFR活躍轉錄；在生長停滯的細胞中，DHFRtinc轉錄，DHFRtinc作為誘餌(decoy)與TFIIB結合，抑制DHFR啟動子轉錄複合體的形成，造成轉錄干擾[51] (圖26)。

圖26.在快速生長的細胞中，DHFRtinc不轉錄，DHFR活躍轉錄；在生長停滯的細胞中，DHFRtinc轉錄，DHFRtinc作為誘餌(decoy)與TFIIB結合，抑制DHFR啟動子轉錄複合體的形成，造成轉錄干擾。

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Airn干擾Igf2r的轉錄

印記基因簇中也存在lncRNA通過轉錄干擾抑制其他基因表達的情況。在Igf2r印記基因簇，Latos等通過不同程度截短Airn，發現Airn通過轉錄干擾抑制Igf2r的轉錄：Airn的轉錄本覆蓋Igfr2啟動子區後即可抑制Igf2r的轉錄，而不是Airn轉錄本本身的功能[52, 53] (圖27)。

圖27.Airn通過轉錄干擾抑制Igf2r的轉錄。圖片引自Santoro et.al, 2013.

3.4lncRNA控制轉錄因子

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Gas5抑制激活型GR與靶基因結合

Gas5(生長停滯特異轉錄本5，Growth-arrest-specific transcript 5)是Schneider在1988年通過消減雜交篩選出的生長停滯細胞上調的lncRNA[54]。在某些環境脅迫因素(如營養匱乏)的脅迫下，Gas5作為誘餌，通過類似於糖皮質激素反應元件(glucocorticoid response elements，GRE)的高級結構域與糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的GRE結合結構域結合，競爭性抑制激活型GR(與糖皮質激素配體結合的GR)與靶基因結合，從而切斷了GR信號通路的轉導(GR的靶基因主要是凋亡抑制基因[55])，進而導致細胞生長停滯甚至凋亡，如阻止激活型GR與cIAP2(細胞凋亡抑制因子2，cellular inhibitor of apoptosis 2)結合，促進細胞凋亡[56] (圖28)。

圖28.在某些環境脅迫因素(如營養匱乏)的脅迫下，Gas5在胞質中作為誘餌，通過類似於GRE的高級結構域與GR結合，競爭性抑制激活型GR(與糖皮質激素配體結合的GR)與靶基因結合，從而切斷了GR信號通路的轉導，如阻止激活型GR與cIAP2結合，促進細胞凋亡。

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lincRNA-p21調控hnRNP-K

p53直接調控lincRNA-p21的轉錄[57]。lincRNA-p21能抑制p53通路下游基因的激活，並調節凋亡。lincRNA-p21能與hnRNP-K(不均一核糖核蛋白K，heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)特異性結合，並通過調節hnRNP-K的定位來實現其部分基因表達調控功能(圖29)。

2015年Bao等[58]的研究發現，在pre-iPS進一步重編程至iPS過程中，lincRNA-p21與hnRNP-K形成的複合體可招募H3K9甲基轉移酶SETDB1及DNMT1至Nanog、Lin28、Sox2等多能基因啟動子區，維持其H3K9me3及DNA甲基化，阻礙重編程。

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Panda調控NF-YA

Hung等[59]的研究發現，DNA損傷能通過p53激活lncRNAPANDA[CDKN1A (p21)啟動子相關轉錄本，p21associated ncRNA DNA damage activated]。研究發現PANDA通過與NF-YA互作，抑制其對與凋亡基因啟動子區的結合，從而起到對凋亡基因的抑制，參與細胞周期的調控(圖29)。

圖29.lincRNA-p21能與hnRNP-K特異性結合，Panda能與NF-YA特異性結合，調控一些凋亡及生長停滯基因的表達。

4

lncRNA參與轉錄後調控

轉錄後調控是指對轉錄得到的mRNA的加工和轉運過程以及穩定性方面進行的調控。在此過程中，lncRNA利用其可以與RNA輕鬆結合的特點來進行調控。比如在mRNA的剪切過程中，如果lncRNA耍無賴結合到了剪切位點上，那麼就導致該位點不能被切割了。比如在mRNA的轉運過程中不小心遇到了核定位的lncRNA，然後lncRNA又耍無賴死活不讓走，那這些mRNA就無效了；而如果遇到了開飛機出核的lncRNA，那麼這些擠火車都不一定能擠上的mRNA(比如沒有polyA尾巴的胞質定位的mRNA就相當於想回家但啥票也沒買到的小可憐)則會迅速到家。再比如在RNA穩定性方面，lncRNA一方面可以與靶RNA直接結合，形成易於降解的結構域或更加穩固的結構域，來直接調控之，另一方面可以與針對靶RNA的miRNA們結合，通過犧牲自己間接保護之。

4.1

lncRNA參與可變剪切調控

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Malat1調控Cat1 pre-mRNA 的可變剪切

以Hala細胞為材料發現，Malat1的5』區域能與SRSF1(富絲氨酸/精氨酸域剪切因子1，serine/argine-rich splicing factor 1)等富絲氨酸/精氨酸域(serine/argine-rich，SR)家族蛋白特異性結合，調節其核斑(nuclear speckles)定位及磷酸化，募集SR蛋白至轉錄活躍區，進而調控mRNA前體(pre-mRNA)的可變剪切，如Cat1(半胱氨酸共軛化合物-α-酮戊二酸轉氨酶，cysteine-conjugate alpha-ketoglutarate transaminase)的pre-mRNA的可變剪切(圖30)[60, 61]。

圖30.Hala細胞內，Malat1能與SR家族蛋白特異性結合，調節其核斑定位及磷酸化，募集SR蛋白至轉錄活躍區，進而調控mRNA前體的可變剪切。

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51A ncRNA參與pre-SORL1的可變剪切

BACE1(β-澱粉樣蛋白前體裂解酶1，beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1)降解APP(澱粉樣蛋白前體，amyloid precursor protein)為Aβ 1-42(澱粉樣蛋白β 1-42，amyloid-β 1-42)。Aβ 1-42的沉積是阿爾茨海默病(alzheimer disease)的病理學特點之一。SORL1A(分選蛋白相關受體1的A亞型，Sortilin-related receptor 1A)是APP全蛋白的分選蛋白，與APP全蛋白結合後影響其在高爾基體囊泡的運輸及酶解過程。51A ncRNA是與SORL1內含子1互補的內含子型lncRNA，參與pre-SORL1的選擇性剪切，導致SORL1A蛋白水平劇烈下降，最終造成Aβ1-42積累，引起阿爾茨海默病[62](圖31)。

圖31. SORL1A是APP全蛋白的分選蛋白，與APP全蛋白結合後影響了其在高爾基體囊泡的運輸及酶解過程。51A ncRNA是與SORL1內含子1互補的內含子型lncRNA，參與pre-SORL1的選擇性剪切，導致SORL1A蛋白水平劇烈下降，最終造成Aβ1-42積累，引起阿爾茨海默病。

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Zeb2-anti參與Zed2的可變剪切

Zed2(E盒結合同源異型框鋅指蛋白2，Zinc finger E-box-binding homeobox 2)mRNA的5』UTR區很複雜，既能形成發卡結構阻止核糖體結合，又含具有內部核糖體進入位點(internal ribosome entry sites，IRES)的調控內含子。在間質細胞中，Snail1激活Zed2反義RNA(Zed2antisense RNA，Zeb2-anti，筆者命名)，Zeb2-anti與Zeb25』UTR結合後覆蓋了調控內含子的剪接供體(splice donor，SD)，調控內含子不被切除，雖然5』UTR發卡結構不能打開，但核糖體可與IRES結合，順利翻譯。在上皮細胞中，不存在Zeb2-anti，調控內含子被切除，核糖體不能閱讀Zeb2，不能產生ZEB2[63] (圖32)。

圖32.在間質細胞中，Snail1激活Zeb2-anti(筆者命名)，Zeb2-anti與Zeb2 5』UTR結合後覆蓋了調控內含子的剪接供體，調控內含子不被切除，雖然5』UTR發卡結構不能打開，但核糖體可與IRES結合，順利翻譯。在上皮細胞中，不存在Zeb2-anti，調控內含子被切除，核糖體不能閱讀Zeb2，不能產生ZEB2。

4.2lncRNA參與RNA亞細胞定位調控

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PTENpg1 asRNA β促進PTENpg1出核

上文提到的PTENpg1不含polyA尾巴，因此其本身不能有效出核。PTENpg1 asRNA β能與PTENpg1相互結合，增加PTENpg1的穩定性並促進其出核進入胞質(圖13)。

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Neat1促進3′ UTR區具有IRAlus結構的mRNA在paraspeckles內的滯留

Neat1(核內富集轉錄本1，nuclear enriched abundant transcript 1)與細胞核亞結構paraspeckles的形成密切相關[64-68]，並且參與了在3′UTR區具有反向重複Alu元件(invertedrepeated Alu，IRAlu)的mRNA在paraspeckles內的滯留[68]，從而抑制了靶mRNA的出核。人類基因組富含Alu序列，因此Neat1在人類中功能可能更顯著，Neat1可能與某些不孕症相關。

4.3lncRNA參與RNA穩定性調控

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BACE1-AS增加BACE1的穩定性

BACE1-AS是與BACE1部分互補的lncRNA [69]，阿爾茨海默病患者的BACE1-AS水平高於正常人。BACE1-AS能與BACE1形成RNA雙螺旋結構，從而增加了BACE1的穩定性，促使APP降解為Aβ 1-42，Aβ 1-42則通過正反饋機制促進BACE1-AS轉錄，從而最終導致Aβ 1-42沉積，引起阿爾茨海默病(圖33)。

圖33.BACE1-AS能與BACE1形成RNA雙螺旋結構，從而增加BACE1的穩定性，促使APP降解為Aβ 1-42，Aβ 1-42則通過正反饋機制促進BACE1-AS轉錄，從而最終導致Aβ 1-42沉積，引起阿爾茨海默病。

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PTENpg1 asRNA β增加PTENpg1的穩定性

上文已經講過(圖13)。

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αHIF促進HIF-1α降解

低氧誘導因子1α反義轉錄本(Hypoxia-inducible factor 1 antisense transcript，αHIF)與低氧誘導因子1 (Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α) mRNA的3』UTR結合後，使其AU-rich區暴露，更容易降解[70, 71]。

4.4lncRNA的ceRNA功能

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PTENpg1作為ceRNA穩定PTEN

上文已經講過(圖13)。

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linc-ROR作為ceRNA穩定Oct4等

在人胚胎幹細胞(hES)的自我更新過程中Linc-ROR[72]能作為ceRNA吸附部分miRNA，如miR-45，從而增強核心多能因子Oct4、Sox2、Nanog等mRNA的穩定性，促進hES多能性狀態的維持(圖34)。

圖34.Linc-ROR作為ceRNA保護Oct4等基因的mRNA。圖片引自Wang et. al, 2013.

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MDRL作為ceRNA促進pri-miR484成熟

線粒體動態相關lncRNA (mitochondrial dynamic related lncRNA，MDRL)參與核內pri-miR484的加工過程，從而參與了線粒體調節[73]。在心肌細胞及腎上腺皮質癌細胞中，miR484能通過抑制線粒體分裂蛋白FIS1的翻譯，抑制線粒體的分裂及凋亡[74]。miR361主要定位於細胞核內，能直接與pri-miR484結合，抑制其被Drasha加工成pre-miR484的過程，而MDRL則可作為ceRNA吸附miR361，起到促進pri-miR484成熟的作用[73]。

參考文獻若干，因字數超過微信限制，故不再羅列。

編輯：純感

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