為什麼你的測序、晶元結果驗證不出來？

如題，今天要回答的問題是：為什麼晶元、測序等高通量數據的實驗結果常常驗證不出來？這裡我們說的驗證不出來意思是指晶元、測序等高通量測序數據顯示某個分子顯著高表達(按照常用標準P2)，而用qPCR、WB等實驗驗證的時候卻發現結果不是高表達的，可能沒有顯著差異，也可能顯著低表達，所以我們說驗證不出來的意思是：晶元、測序等高通量測序與qPCR、WB等實驗驗證出來的結果趨勢不同。

我們從五個角度展開說明：樣本、物種、分子、層次和實驗設計。

一、 樣本不同

這個問題是指做高通量篩選時候的樣本與驗證時候的樣本不同，又包括同類型差異和不同類型的差異。一般我們在做實驗的時候最常常檢測的樣本有三類：組織樣本，體液（比如血液）和細胞，而每種樣本類型又有不同的劃分，比如血液就有全血、血漿、血清等，組織又有新鮮組織、石蠟組織等。

同類型差異是指用的樣本是完全一樣的，只是數量上不同，比如都用新鮮的組織樣本進行篩選和驗證，高通量篩選的時候有2組（每組3例）共6例，而驗證的時候用100對，同類型樣本進行的驗證差異原因主要是個體之間的差異，特別是異質性非常高的疾病，這種情況常會出現。

不同類型的差異是指用的樣本類型不同，比如高通量篩選的時候用血漿樣本，而驗證的時候用組織樣本和細胞樣本，這種情況出現驗證不出來的幾率是比較高的。原因是這樣：血漿反映的是全身各系統的綜合信息，而且多數情況下只有分泌型的分子才能在血漿中檢測到；而組織是器官特異性的複雜體系，比如腫瘤組織就包括了腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞等在內的多種細胞類型，而每個腫瘤細胞的信息都有可能是不同的，這就是腫瘤的異質性；而細胞則來源各異，有的腫瘤細胞株經過多次傳代後形態特性均發生了變化，各個實驗室之間的細胞也差異較大。綜合考慮以上信息，我們一般可以認為細胞的均一性最好，組織次之，血液最差（異質性相反）。

二、 物種不同

分子在物種間的保守性是有差異的，因此即使同種類型的樣本，在不同物種間進行驗證的時候也會出現驗證不出的結果。比如前期通過人的血漿進行的miRNA測序，我們打算用小鼠的血漿樣本進行檢測，就要考慮需要驗證的miRNA分子在小鼠中是否保守，比較極端的例子是小鼠中根本就沒有這個編碼這個miRNA的基因，又如何能保證驗證出人樣本中的結果呢？關於如何查詢分子在不同物種中的保守性，可看文章：如何查詢分子的物種保守性？

三、分子不同

分子不同主要是指一個基因存在多條轉錄本的情況，所以嚴格來說，當驗證的基因有多條轉錄本的時候在設計引物進行驗證的時候就要注意，我們要檢測是後基因還是某條轉錄本，因為一個基因可能對應多條轉錄本RNA。

舉例說明一下，在下圖中，我們就看到GHRL基因至少有10條轉錄本：

所以，即使我們用同樣的樣本，物種也一樣，而各轉錄本RNA之間的差異也可能成為驗證不出來的原因，我們需要考慮的是某一條轉錄本RNA還是所有的轉錄本RNA。

當我們只關注某一條轉錄本RNARNA的時候就可以根據各轉錄本之間的差異進行驗證了，可惜的是由於各轉錄本之間差異性太小，以轉錄本為單位的檢測並非完全可能。

四、層次不同

這裡說的是檢測的分子類型不同，特別是編碼基因的驗證。當我們用WB檢測某個蛋白表達以驗證晶元或者測序裡面的mRNA表達時，我們就在RNA和蛋白這兩個層面進行驗證了，因此從RNA到蛋白過程的所有因素都有可能成為驗證不出來的原因。總體來看，因為mRNA翻譯為蛋白只是蛋白產生的一個因素，而蛋白降解則是影響蛋白水平的另外一個因素了。

除了這個原因外，時間問題也是需要考慮的，因為從mRNA翻譯為蛋白是需要時間的，而這個時間也可能成為驗證結果不一致的原因，比如mRNA升高後要過幾個小時才會伴隨蛋白水平的升高。

隨手畫的，大家懂意思就好。

五、 實驗設計問題

前面四個角度是在實驗設計沒問題的情況下展開的，當然如果實驗設計有問題，出現驗證不出來的問題也是比較正常的。比如我們前面高通量篩選的時候對腫瘤和癌旁的組織樣本進行檢測，由於我們關係的問題是腫瘤的轉移，所以我們通過qPCR對晶元結果中差異表達的基因分別用高侵襲性和低侵襲性的細胞進行驗證，這裡就會存在幾個問題：

1. 樣本類型不同。這裡第一部分我們已經說明了。

2. 實驗設計問題。因為高通量篩選是腫瘤VS癌旁，因此篩選出來的差異基因是與腫瘤的發生相關的基因，而非轉移相關基因；如果關心的是腫瘤的轉移這個因素，那我們在做測序的時候就要選擇腫瘤轉移和非轉移的樣本，兩者之間有關聯但還是不同，促進腫瘤增殖的基因不一定促進腫瘤轉移。

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