基因編輯技術放大招：基於CRISPR/Cas13a的診斷平台可檢測任何RNA分子，靈敏度增加一百萬倍

2017年4月13日Science期刊在線發表論文標題為「Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2」的文章，引發了全球公共衛生領域的廣泛關注。來自美國哈佛大學-麻省理工學院布羅德研究所（以下簡稱布羅德研究所）、麻省理工學院麥戈文腦研究所、麻省理工學院醫學工程與科學研究所、哈佛大學懷斯生物啟發工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）的研究人員，將一種靶向RNA（而不是DNA）的CRISPR相關酶（即Cas13a）改造為一種快速的、廉價的和高度靈敏的診斷工具，能夠指示最少至一個靶RNA或DNA分子的存在。這種新的工具被稱為「SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）」。這種技術可能有朝一日被用來應對病毒性和細菌性流行病爆發、監控抗生素耐藥性和檢測癌症。

該檢測技術由麻省理工學院張鋒教授和James J Collins教授團隊共同建立。

詹姆斯·柯林斯和張鋒

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CRISPR-Cas13a/C2c2系統由嚮導RNA（gRNA）和Cas13a蛋白等部分組成。不同於比較常見的基因編輯工具CRISPR /Cas9，本篇《Science》論文中提到的名為 CRISPR/C2c2 或 CRISPR/Cas13a 的基因編輯技術主要針對不同的基因識別並切割RNA——RNA是一種存在於所有生命形態中的一種主要的生物分子。大多數時候，RNA用於在體內幫助 DNA 合成蛋白質。當Cas13a/C2c2識別到 RNA 標靶時，會發生一些奇妙的事情：它會對附近的非標靶RNA進行剪切。所以，科學家決定將 CRISPR/C2c2 設計成易於使用的診斷工具SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），工作流程是：CRISPR 系統被重新編程，以檢測人的唾液、尿液、血液、皮膚甚至糞便樣品中特定病毒或細菌的遺傳序列。當 CRISPR 檢測到它時，它就會採取相應的切割動作並釋放出熒光信號。因此，研究表明這一技術可以有效而靈敏的的檢測Zika、登革熱病毒，以及區分病原菌，鑒定人類DNA基因型等。

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SHERLOCK技術可用於單個RNA分子的檢測

SHERLOCK技術方便快捷，只要設計特異性的RNA探針，將檢測材料放到一個普通的玻璃纖維紙上，即可以對感興趣的基因進行檢測，成本可能只需要61美分。在新的流行病暴發時候，該技術可以對病原體做出快速、精確的檢測。

該方法可用於完成以下任務：

（1）在幾小時內檢測病人血液或尿液樣品中的寨卡病毒的存在；

（2）區分寨卡病毒的非洲毒株和美洲毒株的基因序列；

（3）區分大腸桿菌等細菌的特定類型；

（4）檢測抗生素耐藥性基因；

（5）鑒定不含細胞的DNA片段中的致癌性突變；

（6）快速從唾液樣品中讀取人遺傳信息，如心臟病風險。

基因編輯技術是神馬？

CRISPR-Cas系統是科學家近年發現並得到迅速推廣和應用的基因剪輯系統。CRISPR-Cas複合體最早在細菌中發現。當噬菌體DNA等入侵細菌後，CRISPR-Cas系統會檢測外來DNA並自我合成一段與外來DNA互補的spacer序列加入CRISPR間區序列，用於對外來DNA定位、切割，消滅入侵者。

科學家很快想到運用CRISPR-Cas定向切割DNA的能力，把它設計成為DNA編輯工具，對宿主DNA進行編輯、改造。科學家對目前研究比較透徹的Cas9蛋白進行改造，製作可以進入真核細胞細胞核的CRISPR-Cas9載體。

近年來以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術在一系列基因治療的應用領域都展現出極大的應用前景，比如艾滋病、血液病、腫瘤等多種人類頑疾。

CRISPR/Cas9基因編輯技術在病毒性疾病的診斷與治療中的新應用：

1、整合HIV-DNA切除

美國天普大學的科學家首次報道了該系統對體外哺乳動物細胞中的整合HIV-DNA的切除，該機構的Khalili等人使用重組腺相關病毒（rAAV）載體運送系統。他們也對這種基因編輯系統進行基因改造以便能夠切割整合到宿主細胞基因組中的HIV-1 DNA，從而導致病毒DNA片段從宿主基因組中切除。在原有研究的基礎上，該團隊進一步實現了CRISPR/Cas9基因編輯系統對成熟人免疫細胞中整合HIV-DNA的切除。

美國天普大學華人科學家胡文輝等人在發表於美國《分子治療》雜誌的最新研究中，首先利用艾滋病病毒感染人源化BLT小鼠，然後藉助腺相關病毒（AAV）作為載體，把有「基因剪刀」之稱的CRISPR／Cas9基因編輯工具運送到潛伏感染小鼠體內。2到4周後，他們在多個小鼠器官組織中檢測到艾滋病病毒基因組被切除。

參考文獻：

[1]. Kaminski R, Bella R, Yin C, et al. Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study.[J]. Gene Therapy, 2016, 23（8-9）。

[2]. Kaminski R, Chen Y, Fischer T, et al. Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing[J]. Scientific Reports, 2016, 6.

[3]. Chaoran Yin, Ting Zhang, Xiying Qu, et al.In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models.[J].Mol Ther, 2017，S1525-0016(17)30110-7.

2、對其他病毒性疾病的診斷與預防

James Collins等人開發出一種低成本的基於試紙的快速診斷系統，該系統能夠毒株特異性地檢測寨卡病毒（Zika virus, ZIKV），而且它可能很快被用來在現場篩查血液、尿液或唾液樣品。這種診斷系統的第三部分就是CRISPR-Cas9輔助的基於紙片的診斷模塊以便區別不同的遺傳特徵序列最少只相差一個核苷酸的毒株。

[4].Pardee K, Green A A, Takahashi M K, et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.[J]. Cell, 2016, 165（5）：1255-1266.

在張鋒和詹姆斯·柯林斯團隊的共同努力下，他們開發出一種依賴於體溫的核酸擴增方法，提高樣品中 DNA 或 RNA 的水平。一旦樣品中的 DNA 水平增加，他們應用第二輪擴增將 DNA 轉化為 RNA，因此使得 RNA 靶向的 CRISPR 系統的敏感性提高了近百萬倍，而且幾乎適用於任何的場景環境。

James Collins 表示：這項技術對科學研究和疾病診斷非常地重要，現在我們可以高效地、方便地檢測任何核酸。

在公共健康方面，CRIPSR/C13a系統的發現是令人興奮的，但仍有大量的工作要做，如果 SHERLOCK 的潛能夠被充分開發，它將會從根本上改變我們對常見的和新興的傳染性疾病的診斷方式。

本文作者：蒲公英

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