生物武器來襲？轉基因牛血或成救命良藥

如何應對生物武器？

U.S. Navy photo by Photographer s Mate 1st Class Shane T. McCoy. (RELEASED), US Navy Newsstand photo, PD

撰文 | 湯波（生物化學與分子生物學博士）

責編 | 陳曉雪

一個異常炎熱的夏天，M國突然發生了一場來勢洶洶的瘟疫，短短几周時間，竟有數萬人感染死亡，所有抗感染藥物均告無效。其傳染速度之快，死亡率之高，前所未見。好在科研人員很快分離出了這種致病微生物，原來是一種集合多種致命病毒的超級人造病毒，被恐怖分子當成生物武器攻擊M國。但是，全世界都沒有針對該病毒的特效藥物，衛生部門一籌莫展，導致疫情一時難以控制，M國深陷恐慌之中。

這當然是某科幻小說里的情節，但是如果未來真的發生這類以人造病毒為武器的恐怖襲擊，一群特殊轉基因牛的血液，或許可以用來生產救命良藥。

牛血能救命嗎？

用動物血清進行免疫治療已有100多年的歷史。19世紀90年代，白喉是威脅歐美兒童健康的主要殺手之一，死亡率在10%以上。德國生理學家埃米爾·馮·貝林（Emil Adolf von Behring）及其同事將患過白喉的老鼠血清注射到新患白喉的老鼠體內後，發現後者竟然痊癒，因此推測感染過白喉的老鼠血清中含有某種對抗白喉桿菌毒素的物質，將其命名為抗毒素。

不久，貝林將白喉桿菌毒素注射到馬、牛、羊等大動物體內，從這些動物血液中分離出能抗白喉桿菌毒素的血清，隨後將這種抗毒素血清注射到病人體內，取得良好療效。自此，抗血清療法成為人類對付傳染性病原體的重要武器。貝林也因為發現抗毒素和發明抗血清療法，於1901年被授予第一屆諾貝爾生理學或醫學獎。

隨著免疫學的發展，科學家發現，這種抗毒素的主要成分其實是動物免疫系統在病原體或毒素入侵機體後，產生的多種不同免疫球蛋白分子，這種混合物能結合同一種抗原，被稱為多克隆抗體。以多克隆抗體為主要成分的動物抗血清一度成為治療肺炎、破傷風和麻疹等多種感染性疾病的重要藥物，有些抗血清藥物沿用至今，中國最新的藥典（2015 版）還將白喉抗毒素、破傷風抗毒素、抗狂犬病毒素、肉毒抗毒素、抗蛇毒血清等抗血清藥物列為重要的生物製品。

但是抗血清的多克隆抗體成分複雜多變，批間差異大，質量難以控制，而且抗體分子為動物源蛋白，容易引發病人強烈的過敏反應等副作用，限制了抗血清的大規模應用，逐漸遭到棄用。目前，只有少數病毒和毒素介導的疾病，如狂犬病、蛇毒等，仍沿用抗血清療法。在很多烈性傳染病爆發期間，也有醫生採用處於康復期的傳染病感染者血清進行抗血清治療，取得了一定療效，但因人源抗血清來源有限，且存在傳播其它致病微生物的風險，也無法大規模應用。

1975年，英國劍橋大學喬治·柯勒（Georges Jean Franz K?hler）和塞薩爾·米爾斯坦（César Milstein）發明了雜交瘤技術，開啟了單克隆抗體時代。相對於多克隆抗體，單克隆抗體是一類結構相同、成分單一的抗體分子，具有高特異性、高功能均一性等優勢，很快在癌症、免疫缺陷等疾病治療領域展現出巨大的應用前景。到2015年底，全球已批准上市的單克隆抗體藥物達50多種，總銷售額約1000億美元，佔到生物藥物市場份額的40%以上。喬治·柯勒和塞薩爾·米爾斯坦也因為發明單克隆抗體生產技術而獲得1984年的諾貝爾生理學或醫學獎。

由於病毒、細菌等病原體感染機體的機制複雜, 而單克隆抗體只能識別單一抗原表位，在抗感染方面作用有限，目前僅有2種抗感染單克隆抗體藥物在美國獲得批准，科學家們希望開發出快速生產抗感染特效藥物的平台，以應對未知烈性傳染病和生物武器的威脅，而利用轉基因動物生產人源多克隆抗體則是其中最為激動人心的創新成果之一。

什麼牛如此「牛」？

為了解決動物抗血清易引發人體強烈過敏反應這一難題，有科學家提出設想，如果能將人的免疫球蛋白基因轉入動物體內，經過免疫後，這些轉基因動物或許能生產出人源抗體。

20世紀90年代，國際上多個研究小組相繼研製出各種轉有人特定抗體重鏈和輕鏈基因的轉基因動物，以生產人源抗體，但這些轉基因動物只能表達單個或少數幾種人源抗體分子。2000年，日本麒麟啤酒公司科研人員發明了一種轉染色體技術，實現了人源多克隆抗體在小鼠血液中表達。這種轉染色體技術，特別之處是將含有人免疫球蛋白的全部重鏈和輕鏈基因序列、最大可達2,000,000個鹼基對的人染色體片段，與著絲粒、端粒和複製起點等原件組裝成新的染色體，再藉助微細胞融合技術，將重組染色體完整轉入小鼠幹細胞，而之前的轉基因生物一般只能轉入長度約數千或數萬個鹼基對的基因片段。

轉染色體小鼠的血液中雖然能表達人源多克隆抗體，但是小鼠個體小，抗體產量太低。有人提出利用牛等大動物生產人源多克隆抗體，主要因為牛的體型大，血量多，少數幾頭牛即可生產出大量抗體藥物，便於質量控制，足以應對嚴重的傳染病疫情。

2002年，日本麒麟啤酒公司和美國Hematech公司等研究機構合作，將轉染色體技術應用到牛身上，培育出一種特殊的轉染色體牛，能在其血液中生產人源的多克隆抗體。轉染色體牛的技術路線與轉染色體小鼠基本相同，主要區別在於轉染色體小鼠是先將重組染色體轉入小鼠胚胎幹細胞，再由小鼠幹細胞直接發育成轉染色體小鼠，而轉染色體牛因為牛的幹細胞技術尚未成熟，只能先將重組染色體轉入牛的體細胞，藉助核移植技術，獲得轉染色體克隆牛。因此轉染色體牛能培育成功，也得感謝體細胞核移植技術的出現。

轉染色體牛製作技術路線圖（Kuroiwa Y et al., 2002）

科研人員在新生克隆牛的血液中檢測到了人的免疫球蛋白，表明人免疫球蛋白基因位點在轉染色體牛體內能正常進行轉錄和翻譯。由於這些轉染色體牛攜帶所有人免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因，理論上，利用任何病原體或毒素對這些牛進行免疫，這些轉染色體牛能生產出相應的人源多克隆抗體。不過，第一代轉染色體牛還存在一些技術缺陷，其中最主要的是人的免疫球蛋白表達量太低，平均僅為幾十微克/升，而人血清中正常人免疫球蛋白濃度可達5-10克/升，因此第一代轉染色體技術難以用於商業化生產。

第一代轉染色體牛（Kuroiwa Y et al., 2002）

根據轉染色體小鼠的結果，研究人員推測可能是牛內源免疫球蛋白基因位點的存在，限制了人免疫球蛋白的表達，但是由於當時牛基因組測序工作剛剛啟動，牛內源免疫球蛋白基因序列也不清楚，科學家還不能對牛內源免疫球蛋白基因進行基因敲除操作。

直到2009年，在美國農業部和貝勒醫學院的領導下，來自25個國家的300多位科學家歷經6年時間完成了牛的基因組測序工作——這一成果發表在美國《科學》雜誌上。同一年，美國Hematech公司等機構的研究人員在第一代轉染色體牛的基礎上，成功將牛內源免疫球蛋白重鏈基因敲除，培育出第二代轉染色體牛，結果該轉染色體牛的血清中人源多克隆抗體含量顯著提高，可達2克/升以上，不過完整的人源多克隆抗體含量只佔抗體總量的10-20%。研究人員還利用炭疽毒素保護性抗原對其中一頭轉染色體牛進行了免疫，然後用炭疽病毒進行攻毒試驗，結果表明轉染色體牛血清中產生的人源多克隆抗體能完全有效地中和炭疽毒素。

與人血清抗體含量相比，上述改進顯然仍沒有達到理想狀態。2014年，該研究團隊再次對第二代轉染色體牛進行了改進，將牛內源的免疫球蛋白輕鏈基因片段也全部刪除，獲得了第三代轉染色體牛——牛內源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因位點全部敲除，但含有完整人免疫球蛋白基因位點。這些轉染色體牛血清中的全人源多克隆抗體含量平均為5克/升，最高可達15克/升，而且全人源免疫球蛋白分子占抗體總量的50%以上，與人血清抗體相當，標誌著生產人源多克隆抗體藥物的轉染色體牛技術平台已經基本成熟。

對埃博拉病毒小試牛刀

轉染色體牛技術平台最初是日本麒麟啤酒公司開發的專利技術，後轉讓給美國Hematech生物技術公司，最近又歸於美國桑福德健康集團。近年來，轉染色體牛技術平台受到美國軍方的重視，美國陸軍傳染病醫學研究所已投入大量資金，計劃與桑福德健康集團旗下的SAB公司合作，共同開發對付埃博拉病毒等致命病原體的人源多克隆抗體藥物。

埃博拉病毒是引發人類和靈長類動物發生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒，可通過與患者體液、排泄物直接接觸，或與患者皮膚、黏膜等接觸而傳染，死亡率高達30-90%。埃博拉疫情1976年首次爆發，已造成10次有規模的爆發流行，2014年再度在西非爆發，感染病例2.8多萬，已造成1.1萬餘人死亡，是近幾十年來全世界最嚴重的一次疫情。但是，目前對埃博拉病毒病尚無特效治療方法，最有希望的埃博拉疫苗仍處於臨床試驗階段。

2015年9月，美國陸軍傳染病醫學研究所和美國SAB公司聯手在《公共科學圖書館·綜合》（PLoS ONE）上介紹了抗埃博拉病毒人源多克隆抗體藥物的研究成果，研究人員利用可表達埃博拉病毒最致命亞型——扎伊爾型和蘇丹型糖蛋白基因的DNA疫苗，對第三代轉染色體牛進行4次連續免疫，第2次免疫後即可檢測到抗埃博拉病毒人源多克隆抗體的產生，第3次免疫之後，即可觀察到高滴度的病毒中和反應；而且一頭轉染色體牛經過10個星期免疫，所生產的埃博拉病毒多克隆抗體可以滿足100-200病人使用，可見轉染色體牛的多克隆抗體生產能力非常之大；研究人員還將純化後的人源多克隆抗體注射到小鼠體內，埃博拉病毒感染試驗結果顯示，免疫保護率可達80%以上。

2016年4月，英國自然科研旗下出版的開放獲取期刊《科學報告》（Science Reports）又公布了一篇關於轉染色體牛生產抗埃博拉病毒人源多克隆抗體藥物的研究論文，作者同樣來自美國陸軍傳染病醫學研究所和美國SAB公司等研究機構。與《公共科學圖書館·綜合》論文不同的是，這次研究人員採用扎伊爾型埃博拉病毒的一種重組糖蛋白作為抗原，對第三代轉染色體牛進行8次免疫，在第3次免疫之後的5個多月里，兩頭經免疫的轉染色體牛血液中能不斷產生大量的高效價人源多克隆抗體，經埃博拉病毒攻毒試驗，對試驗小鼠的免疫保護率可達90%以上，研究團隊接下來計劃開展靈長類動物的攻毒試驗，並開展相關臨床研究，以開發出抗埃博拉病毒的人源多克隆抗體新葯。

顯而易見，當人類面臨未知烈性傳染病爆發，或者恐怖分子發動生物武器襲擊時，轉染色體牛多克隆抗體生產體系具有巨大優勢，一頭轉染色體牛可以在3-5個月時間生產出滿足100多人使用的、免疫保護率高達90%以上的人源多克隆抗體藥物，平時只要保留200頭左右的轉染色體牛，即可應對像2014年西非爆發的埃博拉疫情如此嚴重的傳染病危機。目前，轉染色體牛生產人源多克隆抗體藥物已經在美國申請進入臨床試驗，美國食品藥品監督管理局也出台了關於人血清或動物血清來源的多克隆抗體藥物的審批程序，一旦獲准商業化應用，對於整個人類來說都是巨大的福音。

參考文獻

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2.Kuroiwa Y. et al. Antigen-specific human polyclonal antibodies from hyperimmunized cattle. Nat Biotechnol. 2009;27(2):173-81.

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5.Matsushita H. et al. Species-Specific Chromosome Engineering Greatly Improves Fully Human Polyclonal Antibody Production Profile in Cattle. PLoS One. 2015 Jun 24;10(6):e0130699.

6.Dye JM. et al. Production of Potent Fully Human Polyclonal Antibodies against Ebola Zaire Virus in Transchromosomal Cattle. Sci Rep. 2016 25;6:24897.

此文部分文稿已發表於《科學畫報》，《知識分子》獲《科學畫報》授權使用。

製版編輯：鄧志英丨

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