酵母「造」，水稻「種」，豬「生產」：人血清蛋白短缺或將不再

2017-06-12 湯波 知識分子

圖1：人血清白蛋白空間結構（圖片來源：fineartamerica.com）

撰文 | 湯 波

責編 | 王承志、陳曉雪

《知識分子》微信公眾號：The-Intellectual

對於人體來說，人血清白蛋白（human serumalbumin）不可或缺。它是人血漿中最豐富的一種蛋白質，在正常人血漿中的含量超過血漿蛋白質總量的50%，主要負責維持血管內外壓力平衡和血漿容量，並能結合和運輸一些代謝產物。血漿中血清白蛋白水平偏低往往是某些疾病的信號。

人血清白蛋白還可以儲存起來，挽救一些休克、大出血、手術性失血等重症病人的生命，其臨床用量非常之大，僅我國每年需求量就達420噸。不過，人血清白蛋白總是非常短缺，我國人血清白蛋白產量僅能滿足1/4的市場。科學家們只能想方設法通過基因工程的方法大規模生產人血清白蛋白。在這個過程中，負責指導人體生產人血清白蛋白的基因就顯得非常重要。

走出人體

人血清白蛋白基因位於人的第4號染色體上，約有2.2萬個鹼基對，但負責編碼蛋白氨基酸序列只是其中9%的基因序列，也就是該基因的cDNA序列。

正常情況下，血清白蛋白含量偏低時，人體會產生一種信號，並將這種信號傳遞到血清白蛋白的合成器官——肝臟。肝細胞得到合成指令後，會嚴格按照人血清白蛋白基因提供的「圖紙」，生產出足夠的人血清白蛋白，並送到血液中。

令人驚奇的是，人血清白蛋白會形成一種心形的立體結構（圖1），呈心形的血清白蛋白分子進入血液後就無法停止腳步了，隨著血液在全身循環旅行約1.5萬圈後才被逐步從機體清除出去，這一過程大概需要20天。與此同時，新的蛋白分子被肝細胞合成並補充進血液中。

隨著基因技術的興起，人血清白蛋白基因也被賦予特殊使命，踏上了神奇之旅，去找尋更有效、更便捷、更低廉的蛋白合成工廠，以解決人血清白蛋白短缺難題，挽救更多人的生命。

在細胞中碰壁

1981年，美國一家著名生物科技公司首次克隆人血清白蛋白的cDNA序列，並將其插入到一種大腸桿菌體內，大腸桿菌會將人血清白蛋白基因整合到自己的基因組，分泌出重組人血清白蛋白。經驗證，這種重組蛋白與人血液中的天然蛋白氨基酸序列完全一致。不過該重組蛋白不能形成正確的空間結構，蛋白聚集難以溶解，因而不具備正常功能。

後來又有人將人血清白蛋白cDNA序列引入到一種叫枯草芽孢桿菌的微生物體內，雖然表達出可溶性的重組蛋白，但是其空間結構還是不正確。在細菌體內的嘗試並不順利，人血清白蛋白基因只能尋找其它出路了。

在酵母中重生

在細菌中受挫後，人血清白蛋白基因被人帶到了酵母體內碰碰運氣，幾乎獲得成功。

酵母是人類利用了數千年的一類單細胞微生物，在釀製美酒、製作麵包等方面應用廣泛。上世紀七十年代末，隨著基因工程技術興起，酵母被發現是高效合成外源蛋白的理想工具，不僅具有細菌生長快、遺傳操作簡單的特點，也能像高等生物一樣合成空間結構正確的蛋白質。

1999年，日本科學家培育出了高效合成重組人血清白蛋白的基因工程畢氏酵母，重組蛋白在每升培養液中含量可達10克以上，其分子結構、理化性質和生理功能均與天然蛋白一致。經過一系列臨床試驗，2007年作為治療肝硬化的藥物獲得日本政府批准，2008年在日本正式上市，成為第一個重組人血清白蛋白藥物。但好景不長，由於免疫毒性問題和生產數據造假等原因，2010年該產品又被日本葯監局撤回而退市。

由於重組人血清白蛋白臨床上每個劑量高達10-40克，而且每克售價只有3-5美元，因此人血清白蛋白基因需要繼續旅行，努力找尋成本更低、效率更高的重組蛋白生產方式。

隨植物沐浴陽光

作為高等真核生物，轉基因植物很早就被用來開展農業新品種培育和重組蛋白表達研究。其優勢就是不需要大量昂貴的培養基，只需要足夠陽光，就能利用光合作用生產出大量的重組蛋白。

1983年，世界上第一例轉基因植物——含有抗生素葯類抗體的煙草——在美國成功培植，1994年，世界上第一種轉基因作物——轉基因晚熟西紅柿（現已退出市場）——正式投放美國市場。2016年，全球已有26個國家批准種植轉基因作物，全球轉基因作物種植面積達1.851億公頃，創歷史新高，全球種植總面積累計達21億公頃，相當於美國國土面積的2倍。

人血清白蛋白基因進入的第一種植物是煙草，不過在轉基因煙葉中，重組人血清白蛋白僅占煙葉可溶性蛋白總量的0.02%。之後又在馬鈴薯等植物中獲得表達，但是受限於表達效率偏低、重組蛋白結構不正確等問題，效果並不理想。

經過不懈努力，中國武漢大學教授楊代常和同事克服了這些問題，培育出高效生產重組人血清白蛋白的轉基因水稻，有望開創新的大規模重組人血清白蛋白生產體系（圖2）。研究人員為了人血清白蛋白更適合在水稻種子中合成，對人血清白蛋白基因進行了改造和優化，同時將其與水稻種子特異啟動子組成新的基因，利用農桿菌將新基因轉入水稻基因組中，獲得轉基因水稻植株（圖3）。

圖2：楊代常教授和他培育的人血清白蛋白轉基因水稻（圖片來源：荊楚網）

實驗室培育的人血清白蛋白轉基因水稻植株很快被移植到數百畝的稻田中，如普通稻田一樣，在工作人員的精心照顧下，轉基因水稻茁壯成長，幾個月後就結出的豐碩稻穀。由於採用了水稻種子特異元件，它可指導人血清白蛋白基因只在稻穀中合成，在根、莖、葉等水稻其它組織中檢測不到重組蛋白。就這樣，一個人血清白蛋白基因，轉入水稻中，沐浴著陽光，在稻米中生產出大量的重組人血清白蛋白，無疑是一種節能、環保、高效、低成本的重組蛋白生產方式。

圖3：轉基因水稻人血清白蛋白的生產流程（圖片由楊代常提供）

之後，研究人員攻克了重組蛋白純化難關，將重組蛋白純度提高到99.9999%，徹底解決了注射用重組蛋白雜質過敏問題。2017年5月16日，植物源重組人血清白蛋白注射液獲得臨床批件，成為世界上第一個進入臨床試驗的植物源重組人血清白蛋白產品（圖4）。

圖4：全球第一個獲得臨床批件的植物源人血清白蛋白（圖片來源：futurenowinc.com）

成為動物血液的一份子

由於動物與人存在更近的進化關係，二者的大多數基因具有較高的同源性，動物細胞也能像人類細胞一樣，合成出空間結構和生理功能與天然蛋白完全一致的重組蛋白。

1992年，以色列科學家首次將人血清白蛋白基因和綿羊β-乳球蛋白啟動子組成新的基因，將其轉入小鼠受精卵獲得轉基因小鼠，轉基因小鼠可以將這個來自人類的基因一代代遺傳下去，並在綿羊β-乳球蛋白啟動子的引導下，轉基因母鼠在其乳汁中生產出重組人血清白蛋白，這種生產方式被稱為動物乳腺生物反應器，後來山羊和兔乳腺生物反應器生產的重組蛋白藥物都被批准上市，是繼微生物發酵、哺乳動物細胞培養體系之後，第三代基因工程製藥技術。

2009年，美國GTC生物製藥公司研發人員將山羊β-酪蛋白啟動子與人血清白蛋白基因全序列結合，組成新的基因，並將新基因轉入到奶牛細胞中，通過體細胞克隆技術，培育出轉有新基因的轉基因奶牛。與轉基因小鼠一樣，這些轉基因母牛產奶後，其乳汁中就能檢測到重組人血清白蛋白，每升牛奶中含有1-2克重組蛋白，其中有一頭轉基因母牛重組蛋白高達48克/升。值得一提的是，該公司正是開發出國際上第一個動物乳腺生物反應器重組蛋白醫藥產品的公司。

由於人血清白蛋白主要在血液中分泌，於是有人設想如果利用動物的血液系統，是否能更高效地生產重組人血清白蛋白。2013年中國農業大學科研人員用人血清白蛋白cDNA序列對豬血清白蛋白基因序列進行了替換，培育出血清白蛋白基因人源化的轉基因豬（圖5）。由於採用的是人血清白蛋白cDNA序列，且只替換豬血清白蛋白一個等位基因，屬於雜合子，因此轉基因豬血液中重組人血清白蛋白表達量偏低，僅有0.2克/升，目前該課題組正在進行純合子轉基因豬培育，預計重組人血清白蛋白表達量將有所提高。

圖5：中國農業大學培育的人血清白蛋白轉基因豬（圖片來源：李向清，2017）

據《南方都市報》報道，2016年底中科院廣州生物醫藥與健康研究院利用基因編輯技術，將豬血清白蛋白基因替換成人血清白蛋白基因，已獲得純合子基因編輯豬，重組人血清白蛋白在豬血中含量可達20克/升，下一步將主要需要攻克重組蛋白純度等難關。

結語

在不同生命體中旅行之後，重組人血清白蛋白將帶著人血清白蛋白基因的最初夢想，回到人體，用於治療肝硬化腹水、燒傷燙傷、手術後體液的補充、失血過多導致的休克、腦水腫等病症。除了人血清白蛋白基因，還有很多藥用蛋白基因重複著這樣的故事，為拯救人類的生命而不斷開啟生命之旅。

參考文獻：

1.Chen Z, He Y, Shi B, Yang D. Human serum albumin from recombinant DNAtechnology: Challenges and strategies. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(12): 5515-25.

2.He Y, Ning T, Xie T, Qiu Q, Zhang L, Sun Y, Jiang D, Fu K, Yin F, Zhang W, ShenL, Wang H, Li J, Lin Q, Sun Y, Li H, Zhu Y, Yang D. Large-scale production offunctional human serum albumin from transgenic rice seeds. Proc Natl Acad Sci US A. 2011; 108(47):19078-83.

3.李向清. 血清白蛋白人源化豬的製備[D]. 北京：中國農業大學，2014年.

製版編輯：斯嘉麗丨

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