「並行不悖、井然有序」，葉綠體中二萜代謝流調控的新機制

景傑編者推薦： 植物二萜類化合物具有很重要的生理功能，如葉綠素、胡蘿蔔素等捕色素參與光合作用； 赤霉素、脫落酸、獨腳金內酯等植物激素調控植物生理髮育。葉綠體是植物二萜類化合物主要合成場所。但是讓研究人員始終不解的是，葉綠體中眾多二萜化合物共用同一前體（GGPP），那麼該前體是如何在不同合成途徑中合理分配？日前著名學術期刊PNAS的一篇學術論文給出了答案。領導該研究的是南京大學盧山教授。研究人員在水稻中鑒定到GGPP合成酶（GGPPS）以及與其互作的蛋白GRP。這兩個蛋白在葉綠體的類囊體中形成異源二聚體，相比在葉綠體基質中的GGPPS同源二聚體，可以更高效地合成GGPP，以專供葉綠素合成之需。該項研究揭示了植物在二萜代謝合成途徑精細調控中新機制。

關鍵詞：

萜類、光合作用、GGPP、類囊體、蛋白質相互作用、質譜

圖 1. 植物葉綠體中，二萜前體GGPP參與合成赤霉素（Gibberellins）、胡蘿蔔素（carotenoids）、脫落酸（ABA）、葉綠素（chlorophyll）等重要生理活性化合物。

研究思路和成果：

萜類化合物（terpenoids）以異戊二烯為結構單元，是自然界中種類最多、結構最為多變的一類化合物。通常根據所含的異戊二烯單元數將萜類分為單萜、倍半萜、二萜和三萜。萜類化合物種類繁多，從膽固醇、葉綠素、甾體激素等生理活性小分子；到薄荷醇、青蒿素、人蔘皂苷等藥理活性分子；再到蛋白質的異戊二烯修飾、以及我們熟悉的天然異戊二烯聚合物---橡膠，萜類的身影可謂無處不在 (圖 2)。（第十三屆萜類生物學國際會議於2017年7月16-20日在大連舉行，景傑公司也應邀參展，讓我們相約萜類生物學最高水準的國際會議）

圖 2. 植物萜類合成途徑，以及代表性萜類化合物：10個碳的薄荷醇、15個碳的青蒿素、20個碳的紫杉醇前體taxa-4(5),11(12)-diene。

植物的葉綠體是重要生理活性的二萜類化合物的合成場所， 如葉綠素等光合色素；赤霉素、脫落酸等植物激素。上述化合物在葉綠體的不同區室中合成，雖然共享同一前體GGPP，但是GGPP在不同合成途徑中合理分配是一個未解之謎。

盧山教授課題組一直從事植物萜類代謝調控的研究，在分析水稻基因組時，他們發現 12個被注釋為異戊烯基轉移酶（prenyltransferase，PTS）的基因。隨後克隆上述基因，將這些基因分別融合熒光蛋白，發現有四個基因編碼的蛋白定位在質體中，有趣的是其中兩個蛋白（GGPPS1, GRP）分布在類囊體上 （圖 3）。

圖 3. 水稻GGPPS1和GRP蛋白定位於葉綠體內囊體膜。左圖，將GGPPS1和GRP分別融合YFP蛋白，結果表明上述蛋白定位於葉綠體中。右圖，免疫印跡分析GGPS1、GRP在葉綠體的亞細胞定位。

接下來的生化實驗表明，GRP並沒有催化合成GGPP的活性，雖然GGPPS1可以催化合成GGPP，但是特異性不是很高，除了主要產物GGPP外，還有一些副產物如FPP的產生。有報道表明GGPPS可以通過結合GRP而增加其對底物識別的特異性。本文的研究人員將GRP和GGPPS混合後，發現所有底物都被特異性地轉化為GGPP。這表明雖然GRP自身沒有催化活性，但是可以提高GGPPS1的反應特異性和催化速度（圖 4）。

圖 4. 利用LC/MS檢測體外表達GPPS1、GRP的異戊烯基轉移酶活性。

隨後作者用體外生化實驗（Pull-down）、體內的雙分子熒光互補實驗（BiFC）證實了GGPPS1和GRP間的相互作用。最後還通過X-衍射的方法解析了GGPPS1同源二聚體和GGPPS1／GRP異源二聚體的晶體結構，兩類二聚體在晶體結構上高度類似。蛋白相互作用分析表明，異源二聚體的結合能力強於同源二聚體 （圖 5）。

圖 5. GPPS1同源二聚體和GPPS1／GRP異源二聚體的晶體結構圖。

水稻葉綠體內囊體內葉綠素中的異戊烯基源於GGPP，因此本文作者猜測類囊體中GGPP合成限制因子可能就是GRP和GGPPS1異源二聚體的含量。為此，作者設計了遺傳學實驗來驗證此猜想。他們分別構建了GRP和GGPPS1轉基因水稻，然後分析轉基因水稻中葉綠素、類胡蘿蔔素等二萜類色素的含量、GRP和GGPPS1蛋白的水平。結果表明這兩個基因水平和上述色素含量呈正相關，並且GRP過表達的轉基因水稻中，類囊體膜結合的GGPPS1含量也是顯著增加 （圖 6）。因此，本文的結果表明，水稻GRP蛋白通過和GGPPS1形成異源二聚體，影響了GGPPS的亞細胞定位，從而精細控制二萜合成前體物質GGPP的流向，使得眾多以GGPP為前體的代謝途徑並行不悖、井然有序 。

圖 6. 左圖，轉基因水稻表型。 RNAi轉基因水稻RNAi#GRP中葉片中葉綠素含量降低，葉片偏黃。右圖，過表達GRP的水稻中，類囊體膜上的GGPPS1蛋白含量顯著增加。

萜類代謝調控領域的著名學者，中國科學院院士陳曉亞對本文的成果作出中肯的評價，他認為這項研究發現了水稻葉綠體中的一個新的蛋白GRP，它猶如一個嚮導，將葉綠素合成的關鍵酶帶到葉綠體中的特殊結構（類囊體）中，進而高效地將底物轉化為葉綠素，從而保證這個重要的反應不受其它代謝過程的干擾。細胞代謝是一個複雜的網路，有許多分支，輕重緩急各不相同，但光合作用是葉綠體的主業。GRP蛋白的發現很好地解釋了植物對葉綠素合成的保障機制。水稻是重要的糧食作物，本研究對農作物生產也具有重要意義。

本論文的工作得到國家重點基礎研究發展計劃(973)的支持，研究人員來自南京大學、南京農業大學、上海交通大學、中科院上海植物生理生態研究所以及美國普渡大學。南京大學博士生周飛和盧山教授分別為本文的第一作者和通訊作者。

盧山博士，南京大學生命科學學院教授。博士畢業於南京大學，先後在中科院上海植物生理生態研究所、德國馬克斯普朗克研究所、美國康奈爾大學等著名研究機構從事博士後研究工作。盧山博士專註於植物單萜、類胡蘿蔔素類二萜化合物代謝調控的研究，相關成果發表在PNAS、Plant Cell、Plant Physiology等著名學術刊物。

參考文獻：

Fei Zhou,et al. A recruiting protein of geranylgeranyl diphosphate synthase controls metabolic flux toward chlorophyll biosynthesis in rice,Proc Natl Acad Sci USA,2017

景傑生物通過整合以組學為導向（包括基因蛋白質組學和組蛋白密碼組學）的生物標誌物發現、以生物標誌物為導向的藥物研發、以高質量抗體為基礎的診斷試劑盒開發這三個環節，逐步構建起「疾病精準分層」、「精準藥物研發」、「疾病精準診斷」 三位一體的精準醫療產業化發展的運作鏈條，從而為精準醫療產業化開創出一片廣闊前景, 並開闢出一條可行路徑。

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