實驗時間 RT-PCR 實驗操作

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實驗方法原理

逆轉錄-聚合酶鏈反應 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取組織或細胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，採用 Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

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實驗步驟

一、總 RNA 的提取

按照總 RNA 提取實驗步驟提取組織或細胞中的總 RNA。

二、cDNA 第一鏈的合成

目前試劑公司有多種 cDNA 第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

在 0.5 ml 微量離心管中，加入總 RNA 1～5 μg，補充適量的 DEPC H2O 使總體積達 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，輕輕混勻、離心；

70℃ 加熱 10 min，立即將微量離心管插入冰浴中至少 1 min；

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。輕輕混勻，離心。42℃ 孵育 2～5 min；

加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

於 70℃ 加熱 15 min 以終止反應；

將管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解殘留的 RNA。-20 ℃ 保存備用。

三、PCR

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；

加入適量的 ddH2O，使總體積達 50 μl。輕輕混勻，離心；

設定 PCR 程序。在適當的溫度參數下擴增 28～32 個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在 PCR 擴增目的基因時，加入一對內參（如 G3PD）的特異性引物，同時擴增內參 DNA，作為對照；

電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果；

密度掃描、結果分析：採用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

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注意事項

在實驗過程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過程中，注意避免 mRNA 的斷裂；

為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；

內參的設定：主要為了用於靶 RNA 的定量。常用的內參有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。

其目的在於避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；

PCR 不能進入平台期，出現平台效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標 DNA 起始的數量有關。

故對於每一個目標序列出現平台效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定；

防止 DNA 的污染： 採用 DNA 酶處理 RNA；在可能的情況下，將 PCR 引物置於基因的不同外顯子，以消除基因和 mRNA 的共線性。

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