高遷移率族蛋白Ｂ1調控放療殘存胰腺癌細胞的乾性獲得

[摘要] 目的:研究高遷移率族蛋白B1（HMGB1）對放療後殘存胰腺癌細胞的乾性轉化作用。方法:酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測在不同放療劑量下(0、4、8、10、12 Gy)胰腺癌SW1990細胞上清液中HMGB1的含量；通過不同劑量(0、4、6、8、10 Gy)放療後，流式細胞術檢測殘存SW1990細胞獲得CD133+細胞的比例；獲取10 Gy放療劑量下SW1990細胞的上清液，然後將8 Gy放療後殘存SW1990細胞分成4組：PBS組、上清液+EP(ethyl pyruvate，丙酮酸乙酯，為胞外HMGB1特異性抑制劑)組、上清液組、HMGB1(100 ng/mL)組，流式細胞術檢測各組細胞CD133+細胞的比例，同時 蛋白質印跡實驗檢測乾性標誌分子SOX2和OCT4蛋白表達。結果：ELISA結果顯示，胰腺癌SW1990細胞上清液中HMGB1的濃度在10 Gy放療劑量時最大(217.3±34.97)ng/mL。流式細胞術檢測結果顯示，在8 Gy放療後SW1990細胞中CD133+細胞比例最大(22.63±0.74)%。同時流式細胞術檢測結果顯示，上清液+EP組、上清液組、HMGB1(100 ng/mL)組中CD133+細胞相對於PBS組的比值分別是2.2±0.11、3.2±0.19和6.4±0.32 (F=143.4，P

［關鍵詞］放療； 高遷移率族蛋白B1； 胰腺癌； CD133

[中圖分類號]R735.9［文獻標誌碼］A［文章編號］1671-7783(2017)03-0185-05

DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.y170031

胰腺癌死亡率居腫瘤患者死亡的第4位，惡性程度極高、進展迅速、預後極差。近年來，胰腺癌診治取得了一些進展，系統性的放療僅對部分進展期患者有效，大多數5年存活率依然低於 7％，胰腺癌對放療抵抗為主要原因之一。目前的放療手段在促使絕大多數腫瘤細胞凋亡的同時，更會導致腫瘤微環境的改變。腫瘤微環境中的炎性微環境通過介導複雜的通路，在腫瘤發展的不同階段起著決定性的作用。實體腫瘤的微環境包括細胞因子、生長因子、激素、低pH、低氧和各種細胞外基質等。炎性細胞因子來自腫瘤微環境中的免疫細胞和腫瘤細胞，在體內通過多種方式參與腫瘤的演進轉歸過程，發揮協同或拮抗效應，是導致腫瘤複發的主要原因之一。而高遷移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein，HMGB1)是腫瘤微環境中的重要炎症細胞因子。壞死的腫瘤細胞可釋放HMGB1到微環境中，而細胞外的HMGB1可導致慢性炎症或修復性反應，進而參與腫瘤細胞的存活、進展和轉移。研究證實HMGB1參與調控多種腫瘤信號機制，如JAK/STAT通路、Toll樣受體、糖基化終產物受體（RAGE）的結合等。在結腸癌、前列腺癌、肺癌及食道癌等多種腫瘤組織中均發現了HMGB1的高表達。但HMGB1在腫瘤複發中的作用還不明確，本研究主要闡明HMGB1對放療後殘存胰腺癌細胞乾性轉化的影響。

腫瘤微環境是引起放療抵抗的原因之一，細胞因子是腫瘤微環境主要組成成分。HMGB1是重要的炎症細胞因子，由 215個氨基酸組成，包含A、B兩個基因盒和一個酸性尾端。內源性HMGB1主要存在於真核細胞核內，可與DNA分子結合，參與DNA重組和修復，維持和穩定核小體的結構，調控基因轉錄等。外源性的HMGB1主要由凋亡細胞、壞死的細胞被動釋出或者是由活化的樹突狀細胞等免疫細胞主動分泌到細胞外，可以通過與相關配體結合參與損傷神經組織的修復，細胞增殖、分化遷移，自身免疫性疾病，心血管疾病以及惡性腫瘤各種生物學行為，如腫瘤的發生、轉移[5-6]。越來越多的研究證實外源性HMGB1在腫瘤放化療抵抗中發揮重要的作用。本研究體外結果顯示，放療後胰腺癌細胞上清液中存在大量HMGB1，且其釋放峰值在放療劑量為10 Gy時。

HMGB1可以與不同的受體結合，進而發揮不同的生物學作用。研究表明，HMGB1與RAGE結合，可以誘導細胞遷移、增殖、再生、炎症、自噬等[7-9]；與TLR4結合，主要參與抗腫瘤免疫反應[10]。本研究首次證實，HMGB1可以誘導殘存SW1990細胞獲得腫瘤幹細胞（cancer stem cells，CSCs）的特性，表現為CD133+細胞數增加，SOX2和OCT4蛋白表達增加。CSCs理論認為腫瘤組織中存在少量具有幹細胞特性的細胞亞群，該群細胞表達特性蛋白，具有自我更新、對稱和不對稱的分化以及多系分化的能力[11-12]，CSCs在腫瘤發生髮展、複發和腫瘤放化療抵抗中具有關鍵作用[13-14]。研究證實CD133+胰腺癌細胞具有一些CSCs特性[15-18]。而且，與腫瘤非幹細胞相比，CSCs具有天然的放療抵抗特性[19]。而這一特徵與其自身某些特異信號通路的持續激活相關，如Wnt/β-catenin、Notch 和Hedgehog等信號通路[20-21]。

近年來，雖然針對CSCs的研究取得了突破性進展，但是關於CSCs的起源卻仍不明確。有的學者認為CSCs是由正常幹細胞突變而來，有的學者認為是由分化的細胞通過重編碼過程去分化而來。本研究結果提示：放療殘存細胞中的CSCs主要是在腫瘤微環境中HMGB1的作用下，由腫瘤非幹細胞去分化而來。Conti等[22]證實外源性的HMGB1通過TLR2-Stat3/NF-κB軸促進乳腺癌幹細胞自我更新、腫瘤的發生和轉移，這與本研究的結果基本一致。將放療後上清液與放療後殘存的SW1990細胞共培養後，流式細胞術檢測證實CD133+細胞數明顯增加。而上清液+EP組，由於EP抑制了其中的HMGB1導致其CD133+細胞數降低。這些結果證實HMGB1可促進非幹細胞獲得幹細胞樣特性。同時證實誘導放療後殘存胰腺癌細胞增加了SOX2和OCT4多潛能基因表達。SOX2和OCT4轉錄因子是鼠和人多能幹細胞產物的關鍵基因,特別在胚胎幹細胞和CSCs中SOX2和OCT4的表達對於維持自我更新、可塑性、重新編碼的能力具有基礎性作用。經上清液或外源性HMGB1處理後，放療後殘存SW1990細胞中SOX2和OCT4蛋白的表達增加，這一結果提示，HMGB1可以通過促進腫瘤非幹細胞重新編程進而獲得乾性特徵及表型。

綜上所述，本研究結果證實放療後殘存腫瘤細胞上清液中存在HMGB1，而且HMGB1能夠誘導放療後殘存腫瘤細胞具有幹細胞樣特性，而這一過程主要是通過誘導乾性基因在非幹細胞表達來實現的。本研究為進一步探討HMGB1調控放療後殘存腫瘤細胞具有幹細胞樣特性的信號通路與動物學實驗奠定了基礎。

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