Nature：RNA相變導致神經疾病的機制

BioArt按：從今日起，BioArt將推出「國科大論壇」系列專題文章，旨在鼓勵中國科學院大學（UCAS）生命學院的優秀本科生接觸學術最前沿，激發他們對生命科學某些領域深層次的理解，同時也將會鍛煉他們對科學報道的寫作能力。該論壇的推出，得益於中科院生物物理所苗龍研究員的大力支持。苗老師本學期在中國科學院大學給本科生（2014級，國科大第一屆本科生）講授《發育生物學》課程的同時，給學生布置了相關「作業」並鼓勵他們積極投稿BioArt發表。本著鼓勵學生積極進取、勤于思考的想法，BioArt開闢了這個專欄，給他們提供一個展示自我學習能力的舞台。同時，也希望他們「不忘初心」，有志於將來成為能夠一流的科學家。今日BioArt推出第一篇文章，這篇文章解讀的是近日加州大學Ronald D. Vale教授（HHMI研究員，美國科學院院士，拉斯克基礎醫學獎得主）實驗室在Nature雜誌上以長文形式（Article）發表的題為「RNA phase transitions in repeat expansion disorders」的論文，該研究主要表明了RNA相變對神經疾病的影響及其分子機理。

撰文丨劉燁（中國科學院大學2014級本科生）

摘要：細胞中重複序列RNA異常聚集是許多神經疾病的特點。並且只有當序列重複數目足夠多，達到一定數量閾值的時候，才會出現RNA聚集與疾病特徵。但其中的分子機理還不明確。Nature雜誌5月31日在線發表了題為「RNA phase transitions in repeat expansion disorders」的研究成果，這項研究6月8日正式刊登。來自美國霍華德休斯醫學研究所的兩位科學家Ankur Jain與Ronald D. Vale的研究表明，重複序列的擴張導致RNA分子內多鹼基互補配對，造成RNA進行溶膠-凝膠相轉換。而這種相變可能導致神經疾病。

背景介紹：

短核苷酸重複-擴張（short nucleotide repeat expansion）指一段有核苷酸重複序列的DNA擴張為原來的幾倍。很多常見的遺傳性神經疾病與短核苷酸重複-擴張有關，比如亨廷頓症中的CAG重複，肌張力障礙中的CTG重複，以及家族性肌萎縮側索硬化中的GGGGCC重複。

當這種重複擴張發生在非編碼區的時候，被剪切下來不翻譯的重複RNA序列會異常積累，稱為RNA團簇（RNA foci）【1】 。異常聚集的RNA發生相變，具有類似固體的行為，成為RNA凝膠。只有當核苷酸重複數目達到一定閾值，才會發生RNA團簇。但這種RNA聚集的分子機制還不明朗。

圖1 RNA團簇過程。非編碼RNA鹼基互補作用，聚集成為凝溶膠。引自：Sanders, D. W., & Brangwynne, C. P. (2017). Neurodegenerative disease: RNA repeats put a freeze on cells.Nature, 546(7657), 215-216.

為了解釋重複序列與神經疾病相關的機制，人們提出了幾種假設，其中之一認為，重複序列RNA形成異常團簇積累在核中，隔離RNA結合蛋白，影響其正常作用，破壞細胞自穩態。來自美國霍華德休斯醫學研究所的兩位科學家Ankur Jain與Ronald D. Vale的研究表明，短序列重複RNA特殊的物化性質導致RNA相變，形成團簇，可能通過隔離細胞內相關蛋白，導致神經疾病【2】 。

文章解讀：

首先，為了探究RNA形成團簇的行為，他們用重複序列RNA進行體外實驗，觀察到幾種與已知疾病相關的RNA在微摩爾量級下都形成了團簇，當重複數目達到閾值後，團簇大小隨重複數目增加而增加。光漂白實驗（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）顯示團簇中的RNA行為類似固體，他們將這種狀態的RNA稱作「RNA凝膠」。

隨後他們證實這些RNA最初發生相分離，先變成球狀液滴，但由於分子間的相互作用增加，很快變成凝膠，這也解釋了為什麼只有重複數目達閾值的RNA序列才與疾病相關。為了研究凝膠形成的機制，他們在體外加入干擾RNA鹼基互補相互作用的分子，發現可以消除RNA團簇，從而證實了鹼基相互作用對RNA聚集的重要性。

圖2 a,CAG重複RNA（與亨廷頓舞蹈症相關）鹼基相互作用示例；b,熒光顯微圖，顯示Control組沒有出現聚集，47倍重複的CUG序列與CAG序列出現聚集。

接下來作者開始探究細胞中重複序列RNA的聚集行為是否與體外一致。他們觀察到細胞內的RNA團簇主要存在於核小斑中，但並不清楚其中的原因。核小斑是一種無膜的細胞器，在信使RNA剪接中有重要作用。他們還發現團簇會募集MBNL1蛋白，這種蛋白與神經疾病有關，是細胞發育分化必需蛋白【3】 。結合熒光原位雜交結果，作者得出結論，短序列重複的RNA留在細胞核內，隔離剪接因子。並且當鹼基配對被阻礙時，RNA團簇會被消除，這與體外實驗一致。

圖3 RNA，核小斑與細胞核免疫熒光染色照片。綠色為CAG重複序列，紅色為核小斑。將紅色熒光與綠色熒光重疊（黃色），可以發現重複序列與核小斑在同一位置。

另外，熒光漂白恢復實驗表明體內GGGGCC重複序列聚集的狀態更像固體。相對於CAG重複序列，他們認為兩種RNA聚集狀態不同是因為GGGGCC序列中的鹼基會形成稀有的Hoogsteen配對，進而組成四重螺旋，分子間相互作用更強。Hoogsteen配對與Watson-Crick鹼基配對的區別在於配對時形成氫鍵的原子不同，這使得經典雙螺旋結構被扭曲，在鹼基G數量合適時，容易形成四重螺旋。再一次強調了RNA分子內鹼基相互作用是RNA相變的原因。

圖4 GGGGCC重複RNA多聚化圖示。GQ：四重螺旋；WC：Watson-Crick雙螺旋。

這篇文章揭示了RNA可以自身發生凝膠化，RNA分子內鹼基配對促使其在核內形成聚集團簇，可能通過在核小斑中招募並隔離相關蛋白因子影響細胞功能，導致神經疾病。因此，阻斷RNA自身鹼基配對可能是治療神經疾病的新靶點。

細胞內生物分子的相變，是一種新的細胞器組織形式，會使得我們對許多生命過程提出全新的看法。文章發展了之前發現的「相分離」概念，即RNA和蛋白質可以濃縮成動態的無膜細胞器【4】 ，並證明RNA可以在沒有蛋白質的情況下發生相變，但並沒有建立它與疾病的直接聯繫。重複序列RNA與核小斑募集相關蛋白之間的因果關係也並不明確。那麼，重複序列RNA是否是疾病起因？這種作用的下游反應機制如何？文章留給了我們許多待解決的問題。

值得一提的是，Nature同日在線發表來自普林斯頓大學的David W. Sanders與Clifford P. Brangwynne的文章評論【5】（上圖） 。評論中提到，由於實驗並沒有觀察到RNA團簇細胞的功能異常，並且實驗條件下重複序列RNA的濃度比普通患者神經細胞中的濃度高，本文所揭示的原理對於神經退行性疾病的適用性還有待商榷。另外，對模式生物的研究表明，編碼區的RNA重複序列翻譯會產生一種被稱為「二肽重複」的蛋白質，很可能這種重複序列蛋白而非RNA是導致疾病的主要因素。

RNA重複序列凝集導致神經疾病的工作模型示意圖

參考文獻：

1、Wojciechowska M, Krzyzosiak WJ.(2011).」 Cellular toxicity of expanded RNA repeats: focus on RNA foci.」Hum Mol Genet.20(19):3811-21.

2、Ankur Jain, Ronald D. Vale.(2017).」 RNA phase transitions in repeat expansion disorders.」Nature. 546, 243–247

3、Li, L.-B., Yu, Z., Teng, X. & Bonini, N. M. (2008).」 RNA toxicity is a component of ataxin-3degeneration in Drosophila.」Nature453, 1107–1111

4、Salman F. Banani,Hyun O. Lee,Anthony A. Hyman,Michael K. Rosen. (2017).」 Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry」Nature Reviews Molecular Cell Biology18, 285–298

5、David W. Sanders,Clifford P. Brangwynne.(2017).」 Neurodegenerative disease: RNA repeats put a freeze on cells」Nature546, 215–216

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