淺談基因工程抗體

前言

人體是一個複雜且又統一的整體，需要多個系統共同協作完成其功能。免疫系統作為其中一個系統，在複雜性方面被認為僅次於神經系統。作為先天和適應的保護機制，免疫系統由體液和細胞完成其免疫功能。抗體，作為體液免疫應答的產物，一直以來備受關注。人們可以在合適的宿主中針對抗原產生特定抗體的事實使得它們成為具有看似無限應用的有價值的生物學分子。

Kohler和Milstein在1975年創建了淋巴細胞的雜交瘤技術並獲得了專一識別抗原位並與之特異結合的單克隆抗體，並於1984年榮獲諾貝爾醫學獎。此舉開創了抗體開始廣泛地作為治療性藥物的新時代。單克隆抗體與多克隆抗體相比，可以更有效地發揮藥效並具有更小的毒副作用，已基本取代多克隆抗體用於基礎研究和臨床診斷。1982年，用鼠特異性單克隆抗體治療了淋巴瘤患者的成功引起了人們的極大關注。隨後的幾年中，被譽為「魔法子彈」的單克隆抗體治療腫瘤的生物導彈治療策略如雨後春筍般崛起。大量的鼠單克隆抗體被研發並快速推進於臨床試驗，然而眾多臨床試驗發現，鼠單克隆抗體因對人來說具有異源性，引起患者強烈的人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA）反應；並且由於完整的抗體相對分子量較大，到達組織或靶器官的量極少。因此，單純的用鼠單克隆抗體治療疾病難以發揮理想的藥效，還帶來了難以接受的毒副作用。

20世紀80年代後期，隨著新興的分子生物學的迅速發展，使得人們可以通過基因工程技術對天然的分子進行人為的改造，這為抗體藥物帶來了新的突破點和希望。了解抗體分子的結構和闡明其結構功能關係為使用mAb用於各種應用尤其人類治療領域提供了新的推動力。目前，常規單克隆抗體的生產和抗體工程相結合已經產生了一些具有診斷，研究和治療應用的產品。在本文中，我們將介紹抗體工程抗體的方法，種類，產品及其要點介紹。

一、人源化基因工程抗體改造

1.抗體可變區基因的獲得

目前主要有兩種方法獲得抗體可變區基因，一種從抗體生產細胞中克隆；一種是從抗體庫中獲得。

1）從抗體生產細胞中克隆

從抗體生產細胞，如小鼠雜交瘤細胞，人B細胞等抗體生產細胞中克隆正確和所需抗體的V基因，經過研究者多年的發展並逐步改善，研究者建立一套有效的基於PCR的技術路線和方法。對於從產生單一抗體的細胞如雜交瘤細胞中克隆V區基因，目前普遍採用的是RT-PCR法，先反轉錄製備細胞中的cDNA，然後利用精心設計的套裝引物，採用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)的方法擴增抗體的輕重鏈的V區基因片段，通過電泳分離這些基因片段，克隆到相關載體後，採用測序、測定結合活性等方法進行鑒定。如何成功克隆到目標序列，最關鍵的是擴增抗體V基因的套裝引物的設計，對於不同的抗體來說，雖然其V區基因兩端的序列有可能是不同的，但經過多年的研究總結髮現，各種抗體V區基因的兩側序列具有很高的同源性。通過使用多個同源性高的兩端序列，並結合簡併鹼基的引物設計方案，設計擴增V區基因的套裝引物，從而獲得目標抗體的V區基因的cDNA片段。

2)構建抗體庫獲得抗體的可變區基因

相比傳統的單克隆抗體技術相比，抗體庫技術，具有庫容量大、可篩選種類多、更易獲得針對特定抗原表位的高活性單克隆抗體等無以替代的優勢；同時抗體庫技術在篩選過程中，更為省時、省力、高效、經濟。目前抗體庫根據其宿主免疫狀態來說，主要分為天然庫和免疫庫兩大類。天然庫從理論上來說可以篩選獲得可與任何抗原特異結合的的抗體，同時人抗體庫可以直接產生全人的抗體V區基因，避免了後續的繁瑣的人源化過程，但這些天然抗體基因缺乏體內的重排與突變過程，因而很難獲得高親和的抗體，所篩選的抗體往往需要進一步的親和力成熟改造；同時篩選背景高，針對特定抗原的抗體丰度低。與天然庫相比，免疫庫中含有大量針對該特定抗原的抗體，篩選背景大大降低，並且這些抗體基因經過在宿主體內的成熟過程，往往具理想的親和力。小鼠目前依然是最容易進行免疫和其後續進行基因工程操作的動物品種，然而通過小鼠抗體庫獲得的依然是鼠抗體V區基因，想使其安全用於臨床，還必須進行後續的人源化改造。近兩年發展的全人抗體的轉基因小鼠技術，使得我們可以通過轉有全套人抗體基因的轉基因小鼠來製備人的免疫抗體庫，並從中直接篩選具有治療價值全人的抗體V區基因，無需人源化的改造。當然其也不是萬能的，對於某些無法激活有效免疫反應的抗原，以及本身或其抗體對宿主有強烈的毒性作用來說，仍無法採用人的免疫抗體庫。

2. 選擇合適的恆定區片段構建基因工程抗體

目前作為人類的體內之治療或診斷藥物，基因工程抗體藥物無一例外是來自人抗體IgG型各類恆定區序列。雖然V區決定了抗體的主要效果與作用，但是其通過C區介導ADCC，ADCP和CDC作用,也同時影響患者體內的基因工程抗體的藥效動力學和毒理特性。人IgG型有四種類型，分別為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，除了胚系基因來源不同外，他們的最大差別體現在因鉸鏈區結構不同引起的抗體分子的穩定性不同，以及與效應功能相關的分子（如補體C1，Fc受體）的結合特性不同。IgG1是在人類中存在最主要的IgG型抗體分子，也是目前最為被廣泛採用的,絕大多數已上市或進入臨床試驗的基因工程抗體藥物均採用人IgG1的C區。主要歸因於該類型的分子不僅在體內維持雙價單體的穩定的抗體分子結構，具有較長的半衰期，同時也能介導非常強的效應功能。人IgG3亞類的抗體分子也能介導非常強的效應功能，但由於鉸鏈區較長，使得其在體內的結構不穩定，因而很少被採用。人IgG4亞類也是被經常採用的亞型類別，與FcR結合能力很弱，未與目的靶標結合的游離抗體在體內很快被清除，效應功能很弱。因此，IgG4亞類的抗體主要用於某些不希望抗體出現效應功能以及體內顯像診斷領域。雖然IgG2亞類也僅具有很弱的效應功能，也有了少量的應用，但IgG2存在通過半胱氨酸鏈接交換形成其他的分子結構，包括形成雙體分子，因此同樣應用很少。

3.CDR Grafting

雖然通過將C區替換從而將異源抗體改造為含約75%人抗體組分的嵌合抗體(ChimericmAbs)，但是其V區仍有可能誘導相當強的HAMA效應。因此將V區進一步人源化勢在必行。目前人源化抗體的構建方法有CDR移植、表面重塑、鏈替換、去免疫化等方法，其中應用最廣的是CDR移植，其路線是首先對V區基因進行克隆，確定CDR區和FR區，進而通過資料庫檢索比對和輔助計算機分子模擬等，找出有最大同源性的人FR區模板，綜合考慮、確定需要保留和改變的關鍵鹼基，經基因合成、真核表達、檢測實際結合效果後，對需要保留和改變的關鍵殘基進行相應的修正，最終獲得具有與親本鼠單抗相同抗原表位、高親和力的人源化抗體。其中確定CDR和FR區、需找人FR區模板、確定需要的保留和改變的關鍵殘基是最為關鍵的三個步驟。通過CDR移植的方法不僅將親本鼠的單抗與抗原結合性質賦予了新構建人源化抗體（ Humanized mAbs），並且將人源化程度提高到約95%，進一步降低其免疫原性，基本可滿足要求。

一些用於人治療應用的murine,chimeric和humanized mAbs

二、小分子抗體

目前，人源化、小型化、功能化正成為基因工程抗體藥物的三大主要發展趨勢。小分子抗體體因其分子量小,穿透性強,免疫原性低、可在原核系統表達及易於基因工程操作等優點而受到人們的重視,成為基因工程抗體家族的主要成員和研究熱點。常見的小分子抗體主要包括Fab（由完整的輕鏈和Fd構成），Fv（由VH和VL構成），ScFv（單鏈抗體，VH和VL之間由一連接肽連接而成）及多聚體如Diabody（雙鏈抗體），單域抗體（僅由VH組成），最小識別單位（MRU，由一個CDR組成）以及超變區多肽等多種種類型。而目前研究比較多的是ScFv抗體，Fab抗體，單域抗體等。下面我們將分別討論這三類小分子抗體結構、性質及其特點。

一些小分子抗體的性質、特點及其應用

1.單鏈抗體（singlechain Fv，ScFv）

ScFv是抗體中保留分子完整抗原結合位點的最小功能片段。其是用基因工程的手段將抗體VH和VL通過一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白。分子量僅約為抗體的1/6。在ScFv的分子設計上，理論上VH或VL誰在N端均可，目前尚未發現兩者的位置會對其產生顯著影響的規律，但一旦發現特定的ScFv結合活性大大下降，首先應該考慮更換VH和VL的位置。ScFv構建中,linker的設計往往是成功構建的關鍵。一般要求Linker能促進VH和VL空間摺疊的形成，但又不能干擾VH和VL摺疊形成空間結構過程中的抗原結合位點。這就要求Linker具有適宜的長度和柔性。一般15-18的殘基的Linker長度比較適宜；Linker保持較好的柔性是為了避免影響抗原結合位點正確的空間結構，通常（Gly4Ser）3是一個較易取得成功的通用Linker。值得注意的是，如果在ScFv的C端融合其他片段，例如生物毒素，往往需要在融合片段和ScFv設計一段長度和柔性合適的間隔序列，以防止融合片段對抗原結合位點活性的影響；而在N端融合更為注意，因為N端的空間位置更為接近抗原結合位點。

2.Fab抗體

Fab抗體是一種完整的抗體片段，由重鏈Fd段（VH+CH1）與一條完整的輕鏈組成，兩者之間有一個鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，僅一個完整的抗原結合位點。其具有弱於完整抗體分子但強於ScFv的抗原結合活性，其大小為完整IgG分子的1/3，約為55kDa。Fab抗體的一般特性與ScFv相同，區別在於Fab分子量略大，穿透力下降，且由於含有抗體恆定區，其免疫原性將上升，另外Fab更不穩定，輕重鏈容易解離，造成結合活性喪失。

3．單域抗體

有的動物如駱駝的血液中不僅包含我們熟知的具有輕重鏈的傳統抗體分子，也含有僅僅具有重鏈的抗體的分子，並且這些重鏈抗體的親和力與傳統的親和力相當，因此這些重鏈抗體的單獨的可變區具有很強的很強的結合能力，被稱為單域抗體，因其直徑2.2nm、高4nm，也被稱為納米抗體（nanobody）。駱駝科動物產生的VHH（重鏈抗體單獨可變區）具有許多傳統抗體難以媲美的優點，例如易於免疫，並可識別傳統抗體已不能識別的小表位；僅具有重鏈且屬於同一家族，因此構建文庫時易於克隆且庫容量很小時多樣性就已很強了；天然存在，因此穩定性強、可溶性強。正因為這些優點存在，單域抗體成為一個研究的熱點方向。

三、雙特異性抗體

雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb），又稱雙功能抗體，擁有2個不同的抗原結合位點，從而可以同時與兩個靶標抗原結合，在發揮抗體靶向性的同時，介導另外一種抗體的特殊作用，例如一個結合靶標細胞上的特異性抗原，另一個結合淋巴細胞或吞噬細胞等效應細胞，從而使得效應細胞可以靶向殺滅腫瘤細胞，當然所介導的特殊功能效應分子也可以是毒素、細胞因子等。關於雙特異性抗體的詳細內容，可參看之前的文章《雙特性性抗體：想說愛你口難開》。

結語：

基因工程抗體藥物的出現，解決了抗體藥物在以往的臨床應用所面臨的多種問題，使得新型的基因工程抗體藥物在藥效學、葯動學、毒理學方面具有更為優良或是更為適宜的臨床應用，為目前抗體藥物的興起奠定了重要的基礎。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展,基因工程抗體勢必將會對人類的疾病的治療等領域起到更大的促進作用。

參考文獻

1.Antibody Engineering – An Update. Technical Report ,November 2016.

2.Humanization of antibodies. Front Biosci, February 2008.

3. Engineering antibody therapeutics, Current Opinion in Structural Biology, December 2017.

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