中科院楊輝博士團隊：一步到位，CRISPR徹底敲除動物體內特定基因

葯明康德/報道

CRISPR基因編輯技術是近期業內的一大討論熱點。一周前，《自然》子刊《Nature Methods》上的一篇論文發現，經過CRISPR編輯的兩隻小鼠內出現了不少預料外的基因突變，這也引發了一場關於CRISPR潛在脫靶性的大討論。不少CRISPR的行家們在討論中表示，關於這一結論，我們仍然需要更多設計更為嚴格的實驗進行驗證。

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今日，自然出版集團旗下的《Cell Research》期刊上在線刊登了一篇來自中國科學院神經科學研究所楊輝博士團隊的最新論文。利用CRISPR基因編輯技術，研究人員能夠通過簡單的「一步反應」，徹底敲除小鼠或是猴子體內的特定基因。這一工具對於基礎科研中動物模型的建立能起到提速的作用，意義重大。此外，這篇論文中利用全基因組測序來評估CRISPR潛在脫靶效應的數據，也從側面表明在嚴格的控制下，這一技術的脫靶效應也許並不如《Nature Methods》的論文所提的那樣嚴重。

本項研究的主要負責人楊輝博士（圖片來源：中國科學院神經科學研究所）

先來看看楊輝博士團隊這篇論文誕生的大背景。我們知道，CRISPR技術能夠按研究人員的需求來高效敲除動物體內的特定基因，做到「精準編輯」。但在實際操作中，科學家們常常發現，動物體內總有一些漏網的細胞，逃脫了CRISPR的編輯。這被稱為「嵌合現象」。這種出現嵌合的動物往往需要幾代的培育和雜交，才能得到基因被完全敲除的個體。因此，如何擴大CRISPR技術的編輯面，在源頭做到「不放過一個細胞」，就成了業內研究的一個熱門方向。

先前，不少科學家們嘗試了多種不同的手段，以求達到這一目的。一些科學家嘗試將Cas9的mRNA與嚮導RNA（sgRNA）注射入卵母細胞（oocyte），而不是常用的受精卵（zygote）；一些科學家嘗試過直接注射Cas9蛋白；另一些科學家則注射過多條sgRNA。這些實驗都取得了一定的成果，但獲取基因被完全敲除的動物的效率較低，從而限制了它們的應用。

在本項研究中，來自中國的科學家們做了一個新的設想——如果在受精卵內注射多條sgRNA，是否會提高基因敲除的效率呢？為了檢驗這個想法，他們讓野生型的母鼠與帶有純合Actin-EGFP的公鼠進行交配，並在受精卵中注射入了Cas9 mRNA以及多條靶向GFP的sgRNA。這些sgRNA在GFP基因的外顯子中相隔10-200個鹼基對，研究人員們相信這樣的設計能以更高的頻率敲除特定基因。

研究人員相信，在同一條基因的外顯子中引入多個sgRNA，有望提高基因敲除的效率（圖片來源：《Cell Research》）

在後續的分析中，研究人員的設想得到了證實。在沒有經歷基因編輯的對照組中，所有發育中的囊胚（blastocysts）都帶有GFP的綠色熒光。在只有1條sgRNA注射的情況下，大約有31%-44%的囊胚沒有出現綠色熒光，表明GFP基因得到了敲除。但是剩下的那些囊胚則展現出了「嵌合現象」，即部分細胞的GFP被敲除，部分細胞依舊有GFP基因。而在使用2條，3條，乃至4條sgRNA的實驗組中，所有接受注射的囊胚中，GFP信號都消失了。這表明靶向的基因得到了完全的敲除。值得一提的是，多條sgRNA的引入並不會影響囊胚的生存。

隨著sgRNA數量的增加，表達GFP熒光的細胞也隨之減少（圖片來源：《Cell Research》）

由於在該實驗中，GFP基因在受精卵中屬於雜合狀態（只有父親為受精卵提供了GFP的基因），研究人員隨後進一步測試了該方法敲除純合子中特定基因的能力（即同時敲除兩個等位位點）。這一次，他們的目標是酪氨酸酶基因Tyr，它會影響小鼠色素的形成。在這項實驗中，研究人員開發的工具得到了類似的出色成果——使用3條或4條靶向Tyr基因的sgRNA後，所有的小鼠呈現「白化」癥狀，表明相關的成色基因已被徹底敲除。相反，如果使用1條或2條相關的sgRNA，效果則沒有那麼好。這一結果再次表明，通過引入多條sgRNA，人們可以極大提高在動物體內的CRISPR基因編輯效率，做到對特定基因的完全敲除。

多條sgRNA敲除了小鼠體內的成色基因，讓它們變白（圖片來源：《Cell Research》）

接下來，研究人員又測試了這套系統在猴子里的效率。在神經科學領域，猴子是主要的動物模型之一，並且因為與人的接近而受到研究人員的喜好。一些專家們指出，在「中國腦計劃」中，以非人靈長類動物為模型，研究人員能夠研究思考、自我意識、共情和語言等人類的高級認知功能。建立起合適的動物模型，也就成了研究的重點之一。與小鼠不同，猴子的生長周期較長。如果CRISPR基因編輯技術僅能部分敲除特定的基因，研究人員就需要用很長的時間去進行純合動物的建立。這無論從科學角度，或是倫理角度，都不合適。如果這套系統能夠在猴子體內一步到位，徹底敲除特定的基因，無疑是個重大利好。

在猴子實驗中，研究人員在29個胚胎中各自注射了3條靶向Prrt2基因的sgRNA，這個基因的突變會導致陣發性運動誘發的運動障礙（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD）。這些胚胎被移植入了9隻代孕的母猴，並成功讓其中一隻母猴生下了兩隻小猴。其中一隻小猴的組織樣本表明，Prrt2基因得到了完全的敲除。這個結果也表明了這套系統在猴子體內的可行性。

這隻小猴體內的Prrt2基因得到了徹底敲除（圖片來源：《Cell Research》）

接下來，研究人員分析了這套系統的脫靶效應。這篇論文提到，利用全基因組測序的手段，他們對活體動物進行了CRISPR潛在脫靶效應的評估。在小鼠的10201個潛在脫靶位點，以及猴子的19447個潛在脫靶位點中，他們發現的插入/刪除突變（indels）並不多見。其中有6隻小鼠和1隻猴子的體內未檢測出插入/刪除突變。這也在一定程度上，支持了CRISPR技術的安全性。

總結來說，研究人員們表示他們開發了一種全新的策略，能夠「一步到位」，在小鼠與猴子體內減少CRISPR編輯中出現的「嵌合現象」。將來，他們希望能測試更多的基因位點，並且研究這套系統在其他物種，比如其他非人靈長類動物里的應用前景。

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