「流式細胞儀在酶改造中的應用」直播的圖文版來啦！

基於熒光激活細胞分選（FACS）的酶活性超高通量篩選體系開發與應用

P1

親愛的觀眾朋友，大家晚上好，我就是傳說中的美女博士，我叫譚玉萌，來自上海交通大學，今天給大家分享的是「基於熒光激活細胞分選（FACS）的酶活性超高通量篩選體系開發與應用」，簡言之「流式細胞儀在酶改造中的應用」。在開始報告前呢，我先給大家講一下為什麼要將流式細胞儀應用於酶改造領域。

P2

說起酶呢，大家都不陌生，我們的衣食住行都離不開酶，上至醫藥/食品農業，下至環保、化工，就近幾年興起的代謝工程和合成生物學也離不開酶的催化。根據2016年統計發現，酶製劑全球產值60億美元，推動下游產值在千億美元以上，且品種和應用均處於快速增長階段。

P3

但是呢，天然存在的酶常常存在催化效率低、跨物種匹配性差的缺點，因此常常需要蛋白質改造技術以實現效率最優化。

P4

定向進化技術在實驗室中模擬自然進化中的關鍵步驟：突變、重組和篩選，獲得具有所需性質的突變體。廣泛地應用於提高酶地穩定性、底物特異性、立體選擇性、酶活性等方面。

P5

篩選通量不足於突變庫龐大數量之間地矛盾，是制約定向進化實驗成功地最主要原因之一，舉個例子，從高達10億地突變庫中篩選出三個有義突變，相當于海里撈針。那麼，怎樣才能最大程度地提高獲得陽性突變體呢？

P6

傳統地篩選方法，例如平板篩選、96篩選需要用到大量昂貴地底物，且每天只能篩選1000個突變體，篩選通量較低。為彌補現有篩選方法地不足，基於流式細胞儀的熒光激活細胞分選（FACS）篩選方法應運而生。流式細胞儀是專門用於單顆粒（如細胞、微球、微液滴等）高效檢測的儀器，可以定量地提供單個顆粒大小、結構、熒光強度等信息，並能夠從大量樣品中分選出具有特定性質地群體。流式細胞儀具有極快地檢測速度，在一個項目周期內可處理地樣品可達1010個，因此也被稱為「超高通量篩選方法」。

P7

下面主要介紹兩種流式細胞儀在酶改造領域的應用，第一種是，胞內熒光捕獲。這種方法首先是來自於加拿大的W……教授所開發。我先給大家簡要地介紹一下這種方法的原理：熒光底物，它可以通過細胞表面的乳糖穿透酶，自由的進入細胞，在胞內酶的催化作用下生成產物。但是產物呢，由於結構和大小與底物不同，不能被細胞表面的乳糖穿透酶所識別，因此可以富集在細胞內。且信號強度的高低與酶的活性成正比，因此可以用流式細胞儀進行篩選。我們實驗室的老師根據這種熒光捕獲的原理將單熒光底物改成雙熒光底物，這種雙熒光底物的使用，可以避免酶對單一熒光底物的親和力降低而導致假陽性的產生。就是說我們的熒光基團包括兩部分，第一部分是底物，第二部分是熒光的基團。在篩選的過程中，有可能是我們的酶對熒光基團親和力提高，而不是對底物親和力提高。因此為了避免這種現象，我們開發了兩種熒光底物！

P8

我們老師將這兩種熒光底物應用到中性的糖基轉移酶，β-1，3-半乳糖基轉移酶CgtB。半乳糖基轉移酶催化半乳糖從供體UDP-Gal到受體GM2，生成神經節苷脂GM1，GM1廣泛地應用於治療中樞神經系統損傷和神經退行性疾病。但這類酶地催化活力較低，制約了其應用。

P9

基於這個目的，我們開發了針對β-1，3-半乳糖基轉移酶超高通量篩選方法。這種超高通量篩選方法用於這個酶之後，通過3輪的FACS篩選就將酶的催化活性提高30倍！大家可以看一下熒光富集圖的橫縱坐標，橫坐標代表coumarin，它是代表一個熒光基團；縱坐標代表Bodipy，是另一種熒光基團。從初始的熒光的富集和3輪篩選後的熒光富集圖，我們可以看到3輪篩選之後，coumarin和Bodipy的信號都明顯增強，說明我們已經獲得了良好的突變體。此外根據這種原理還可以應用於其他酶，現在我正在做的就是一種岩藻糖基轉移酶，它應用於抗腫瘤藥物，我們也開發了FACS篩選方法。我這個酶的活力也得到了很好的提升，一篇文章正在撰寫中！

P10

流式細胞儀在酶改造領域的另外一種應用。也就是二級微液滴介導的IVC的FACS篩選體系。最早由是Tawfik和Griffiths建立，體外區室化（IVC）體系通過形成「油-水」（water in oil）或「水-油-水」（water in oil in water）的微液滴來模擬天然細胞的結構，將編碼酶的基因和無細胞蛋白質表達體系（或整個細胞），以及酶底物、產物全部包裹在同一微液滴中，從而建立基因型和表現型的歐聯。IVC產生液滴的直徑可小至1微米，在1mL的油相中即可輕易製備超過1010個微液滴，而且能夠在較高溫度下保持很長時間，這使得IVC成為高通量篩選的理想手段。

這種二級微液滴介導的IVC的FACS篩選方法用於提高巰基內酯酶的活性和半乳糖甘酶的活性，經過3輪的篩選獲得了較好的突變體。

P11

液滴體系除了酶分子進化之外，還有潛力用於合成途徑、分解途徑、蛋白分泌等進化體系。其中的關鍵就是將所檢測的目標轉化為熒光信號，然後就可以進行FACS篩選。這裡面有許多可以應用的技術，比如熒光底物和熒光探針、基於核酸適配體的生物感測器等。比如今年的Nat biotech上面發表一篇文章介紹了一種使用級聯酶進行熒光檢測的技術，通過目標化合物的氧化酶和辣根過氧化物酶進行活性偶聯，可以實現多種代謝產物的熒光檢測，比如氨基酸、脂肪酸、乳酸、木糖消耗等等，都可以通過這一體系進行篩選。

P12

我們實驗室將這種微液滴的體系應用於嗜熱酯酶AFEST的定向進化，通過兩輪的篩選，就獲得酶催化效率提高2倍的突變體。

P13

以上我們介紹了兩種FACS酶活性篩選體系。第一種是胞內熒光富集，現在給大家複習一下胞內熒光富集的原理，這種胞內熒光富集原理就是根據酶的熒光底物可以自由的進入細胞，在酶的催化下生成產物，產物不能倍乳糖穿透酶識別，因此不能出細胞，這樣一種原理進行篩選。

第二種呢，二級微液滴介導的體外區室化（IVC）體系，細胞形成油水，或水油水的微液滴來模擬天然細胞的結構，將編碼酶的基因和無細胞蛋白質的體系包裹在同一個液滴內，從而建立基因型和表現型的偶聯。

另外還有其他流式細胞儀的應用，例如細胞膜熒光吸附，熒光蛋白表達活性報告，基於細胞理化性質熒光探針活性報告，微珠介導的體外區室化。然後這四種應用大家了解一下就行，具體方法可查看文獻。

P14

本期問與答

關於1、熱穩定性改造；2、表達量提高的策略，

請關注公眾號，進入以下直播間收聽直播內容！

進入直播間步驟：

1長按以下圖片

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！