細胞轉染選購指南

細胞生物學家往往需要將外源分子送入細胞進行研究，比如質粒DNA或siRNA。化學試劑、電穿孔和病毒遞送系統是目前最常用的三種途徑。除此之外，人們還在探索全新的轉染方法。這篇文章就對最新的一些轉染產品和方法進行了詳細的介紹。

細胞生物學家往往需要將外源分子送入細胞進行研究，比如質粒DNA或siRNA。化學試劑、電穿孔和病毒遞送系統是目前最常用的三種途徑。

遞送方法的選擇主要取決於目標細胞的類型，需要遞送的分子，以及研究所需的轉染效率。「人們用得最多的是最簡單的方法——化學轉染，」Mirus Bio公司的Josh Snow說。

化學轉染試劑旨在減少細胞對核酸的排斥（二者都帶負電荷），促使細胞膜通過胞吞、胞飲或融合攝入外源物質。對於容易培養和轉染的細胞系來說，傳統的化學和物理轉染（如電穿孔）就已經足夠了。不過化學試劑往往對細胞有毒，轉染原代細胞、幹細胞或者其他難轉染細胞的效率也比較低。雖然病毒遞送對許多細胞類型的效率很高，但使用起來比較麻煩，還需要採取特殊的防護措施，對操作者的專業要求也比較高。

目前已經有不少廠家注意到了上述問題，開始開發更有效的細胞轉染產品。舉例來說，此前Life Technologies發布的Lipofectamine 3000，該產品專門針對「難轉染細胞和原代細胞」，該公司的Xavier de Mollerat du Jeu說。Mirus Bio公司也為那些難轉染的細胞類型開發了新轉染試劑，包括皮膚細胞、神經細胞、乳腺癌細胞和血細胞。

Exo-Fect

System Biosciences

systembio.com

Exo-Fect是一種非脂質體的轉染試劑，可將核酸（包括質粒DNA、mRNA、microRNA和siRNA）直接送入事先分離到的胞外體exosome。胞外體是細胞分泌出來進行通訊的小囊泡，能夠與其他細胞融合或者經由內吞作用被細胞內化。轉染了外源核酸的胞外體，可以成為理想的運輸工具，System Biosciences公司的Travis Antes說。

首先，用戶需要通過超速離心或者使用商業化的胞外體分離試劑盒來分離胞外體。System Biosciences、Life Technologies等公司都提供有這樣的產品。另外，研究者也可以直接從System Biosciences公司買到已經分離好的胞外體。

這個轉染方案非常簡單，用戶先將胞外體、核酸以及Exo-Fect試劑混合在一起，在37度下加熱10分鐘，然後在冰上冷卻半小時。之後可以用另一個試劑將胞外體沉澱下來，將其與轉染試劑和未轉染的核酸分離。完成整個過程大約需要45分鐘，每個轉染反應需要約一百萬胞外體（應該足以處理六孔板中兩個孔的細胞）。

優勢：胞外體介導的遞送是無毒的，沒有引起細胞死亡。胞外體可以遞送不同類型核酸的混合物。Exo-Fect轉染試劑盒中含有一個熒游標記的非靶向性siRNA，可以用來監控轉染和核酸遞送的效果。

挑戰：在某些情況下，胞外體的分離可能費時費力。這個產品是今年四月發布的，接受廣泛檢驗的時間還沒那麼長。細胞培養中常用的胎牛血清（FBS）含有大量的胞外體，會干擾胞外體介導的分子遞送。System Biosciences公司推薦用戶使用去除了胞外體的FBS。

成本：Exo-Fect試劑盒售價是10個轉染反應$195，20個反應$350。胞外體分離試劑盒$288起，50 mL去除了胞外體的FBS是$153。預先分離好的胞外體$350起，一個管大約含有一百萬胞外體。

CellSqueeze

SQZ Biotechnologies

sqzbiotech.com

CellSqueeze是2013年上市的一個微流體系統，能夠將各種物質（包括siRNA、藥物、蛋白或納米顆粒）送入幾乎任何細胞。這個矩形微流體晶元含有75個並行通道，每個通道直徑30微米，其中設計有小於細胞直徑的窄道。

當細胞擠過窄道時，質膜會暫時出現孔洞，允許細胞外的分子通過擴散進入細胞質，之後細胞膜又會很快閉合。這種方式「看來並未對細胞產生任何長期的副作用，」SQZ的創始人之一，哈佛醫學院的博後Armon Sharei說。

CellSqueeze微流體系統帶有一個壓力調節器，可以控制細胞在通道中的流速。晶元上方還有兩個與出入口相連的細胞池。用戶只需要把轉染物質加入到細胞中，再將混合液填入細胞池，就可以啟動壓力運行整個系統。樣本流過整個系統只需要大概五秒鐘，Sharei說。

優勢：使用簡單而且速度非常快，Ragon研究所的Morgane Griesbeck評價道，他正在用這個設備遞送重組蛋白。CellSqueeze適用於多種細胞類型，包括傳代細胞系、胚胎幹細胞等。還能同時遞送多種物質。

該公司提供了16種長、寬和窄道數不同的微流體晶元，用戶可以變動這些參數根據自己的實驗進行優化。經驗證，CellSqueeze能夠可靠遞送2 MDa的分子，「我們目前就測試了這麼大的分子，可能更大的物質也能進入細胞，」Sharei說。

與傳統遞送策略不同的是，整個過程不需要緩衝液或載體，而這些都可能對細胞產生毒害。

挑戰：該系統目前還不適合遞送DNA和mRNA。「mRNA和DNA都能夠進入細胞，但有某種東西阻礙了它們的表達，」Sharei說。「我們已經找到了癥結所在，並通過初步試驗解決了這個問題。」

CellSqueeze的細胞池最大容量為250 μL，更大體積的樣本需要分批進行。操作這個設備需要先經過兩三次培訓。另外該設備的支架慢慢會變松，需要定期更換，Griesbeck提醒道。

成本：每個微流體晶元售價$50。CellSqueeze入門款試劑盒含有壓力系統和兩個支架，售價為$3,000。現場的新手培訓需要大約$800到$1,000。這個系統目前只發售給「得到認可的合作夥伴」，Sharei說。在購買之前用戶需要諮詢該公司的科研團隊。

GNOME（金納米顆粒介導的激光轉染）

Leibniz University Hannover, Germany

GNOME轉染方案主要是通過短脈衝激光，在細胞膜上刺出微小的孔洞，使細胞外的分子能夠擴散進入細胞質。研究者們嘗試這一策略給細胞遞送分子已經有十多年了，但傳統方案的速度非常慢通量也很低。

Dag Heinemann及其同事首先將細胞與直徑約200 nm的金納米顆粒共同孵育，讓它們慢慢沉積到細胞上。三個小時之後，研究者們用短脈衝的綠色激光束照射樣本。這一過程在研究者自製的自動化設備中進行，該設備帶有能夠移動培養皿的自動載物台和軟體，以便快速照射樣本。

吸收了這些光之後，金顆粒中的電子會快速震蕩並發熱。研究者們還不完全清楚之後發生了什麼事件，不過結果是細胞膜上出現了孔洞。Heinemann的研究團隊使用這一技術將siRNA引入了犬類的癌細胞系，對一個基因進行了有效的knocked down（PLoS One, 8:e58604, 2013）。據估計，差不多有90%的細胞被成功轉染，處理之後的細胞超過80%仍有活性。

優勢：GNOME轉染非常溫和，「我們獲得了很高的細胞活性，敏感細胞一般也能達到90%，」Heinemann說。

GNOME可實現高通量，能夠在四五分鐘以內處理一個96孔板的細胞。

兼容多種細胞類型，而且高度可重複，「因為物理過程可以始終如一，而細胞並沒有積極的參與其中，」Heinemann說。他與其他團隊合作，已經成功轉染了好幾個難以轉染的細胞系，包括原代神經細胞、心肌細胞和幹細胞。

除了轉染siRNA，Heinemann還用這一方法向細胞內遞送了蛋白、小分子以及合成的寡核苷酸（morpholinos）。

挑戰：GNOME遞送質粒DNA和其他較大的分子效果不佳。「質粒對於我們在細胞上開的孔而言太大了，」Heinemann說。

另外，金顆粒最終會進入細胞，這有可能會改變細胞的行為。「但就我們所知，這些顆粒在生物學上是完全惰性的，它們不會對細胞產生影響，」Heinemann說。

這一技術還處於試驗階段。Heinemann正在開發簡單按鍵就可以操作的用戶友好型樣機，希望可以放在細胞生物學實驗室里使用。他預計可以在一年內完成這一系統。

成本：現在這一系統還沒有定價，不過Heinemann估計這一設備將能與電穿孔系統競爭，電穿孔系統一般零售價在$10,000以上。

（特別提示，文中列出的價格均非國內售價）

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