新稿速遞┃HPLC法同時測定食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O的含量

HPLC法同時測定食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O的含量

李莎1 2,王銀花1,3, 葉麟1，申光輝1, 張志清1*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶，401120) 3(四川省內江市隆昌縣食品藥品監督管理局，四川 隆昌，642150)

摘 要：建立了同時檢測食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O兩種非食用色素HPLC方法。樣品經V(甲醇)∶V(水)=70∶30超聲提取，經C18小柱凈化後上樣。色譜條件採用Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=50∶50溶液,流速1.0 mL/min,檢測波長450 nm, 柱溫35℃。結果表明：酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O在進樣濃度2.5～12.5 μg/mL內呈良好的線性關係，線性方程分別為Y=2×106X-1 240.1(r=0.999 9)，Y=7×106X-5 284.2(r=0.999 6)，二者檢出限分別為0.120和 0.032 mg/kg，在5類食品中的加標回收率分別為80.33%～90.47%和80.17%～102.64%。經方法學評價和抽樣分析，該方法簡便準確，重複性好，可作為食品安全檢測中同時檢測酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O參考方法。

關鍵詞：食品安全；酸性橙Ⅱ；鹼性嫩黃O；HPLC

工業色素與食用色素有著本質上的區別，是絕對禁止在食品中添加使用，但某些生產商在食品生產過程中為了降低成本、賦予食品穩定而誘人的外觀色澤而違法使用非食用色素，國家衛生部公布的首批17種食品中可能違法添加的非食用物質名單中就有蘇丹紅、玫瑰紅B、鹼性橙Ⅱ(王金黃、塊黃)、鹼性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、美術綠等6種工業色素[1]。酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O比其他水溶性染料更易染色且不易褪色，但是目前尚無這2種非食用色素的國家標準(推薦)分析方法，因此食品安全檢測機構往往缺乏有效方法進行檢測。

目前國內外對食品中非食用色素的檢測方法主要有電離質譜法[2]、薄層色譜掃描法[3-5]、HPLC方法[6-7]、UPLC-MS[8]質譜聯用方法、示波極譜法[9-10]、毛細管電泳法[11]、分子印跡技術[12]、酶聯免疫法[13-14]、熒光光譜法[15]等。其中，高效液相色譜法(HPLC)應用於食品中合成色素與非食用色素的測定最為廣泛。由於食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O檢測時往往受到其他組分的干擾,且被檢測物性質差異較大，需要採用梯度洗脫，分段檢測波長等技術手段。本研究的目的是優化樣品處理方式和色譜條件，建立同時快速檢測食品中酸性橙Ⅱ、鹼性嫩黃O這兩類非食用色素的HPLC方法，並對市場上的部分食品樣品進行抽檢，以確定建立的HPLC檢測方法的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉製品(雞爪、滷製品)、豆製品(豆腐皮、腐竹)、榨菜、黃魚、調味品(辣椒粉，豆瓣醬，辣椒油)等，購自四川省雅安市本地市場；酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O對照品，購自上海金穗生物科技有限公司(CAS號分別為633-96-5 2465-27-2，純度≥95.0%)；甲醇、乙腈(色譜純)，PRC公司；其他試劑為分析純，成都市科龍化工試劑廠；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

島津LC-10A高效液相色譜儀，日本島津製作所；UV-3100紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Milli-Q型純水儀，美國Millipore公司；CP225D型電子天平，德國Sartorius公司；MICROMAX型台式離心機，美國Thermo公司；HS6150D型超聲清洗器，恆奧科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合對照品配製

準確稱取酸性橙Ⅱ、鹼性嫩黃O標準品各0.052 6 g，分別置於50 mL容量瓶中，甲醇溶解並定容至刻度，得到濃度為1.0 g/L的對照儲備液。分別吸取酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O各1 mL的標準儲備液到50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配製成20 mg/L的混合對照儲備液，於-4℃避光保存，檢測時用流動相稀釋成所需濃度的混合對照溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取200 g樣品，破碎均勻，然後稱取5.00 g置於50 mL容量瓶中，加入20.0 mL(V(甲醇)∶V(水)=70∶30)提取劑，超聲提取2次，每次20 min,中間間隔5 min 冷卻，超聲結束用提取液定容至50 mL；溶液轉移至離心管中以5 000 r/min，20 ℃，離心10 min，上清液過C18小柱凈化，然後用0.45 μm濾膜過濾後上樣。

1.3.3 色譜條件

2 結果與分析

2.1 系統適應性分析

分別對不同樣品提取液和相應混合標準液，按優化方案進行測定，分別確定相應的酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O保留時間、理論塔板數、酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O與臨近峰的分離度R和拖尾因子。精確吸取10 μL一定濃度的混合標準品溶液和處理好的3種加標樣品(腐竹、黃魚、辣椒粉)在上述優化好的色譜條件下檢測，結果如圖1。

圖1 HPLC同時測定酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O色譜圖

Fig.1 The HPLC chromatogram of simultaneous determination of Acid Orange II and Auramine O

表1 HPLC同時測定酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O色譜條件下的系統適應性

Table 1 The system suitability of simultaneous determination of Acid Orange II and auramine O by HPLC

此時鹼性嫩黃O、酸性橙II的理論塔板數分別為2 808.680、4 017.508；分離度R分別為4.700、6.284，不對稱度分別為1.534、1.174(圖1，表1)。雜質峰與目標峰分離度較好，此外實驗中為確保樣品中的2種色素能與樣品其他成分分離，對加標樣品也進行的色譜分析[圖1(b)～(d)]。說明該色譜條件下能夠有效的檢測並分離出食品中違法添加的酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O。

2.2 線性關係考察

分別吸取25 mL的2種對照儲備液置於50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配成0.5 mg/mL的對照工作液，再分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 2種對照貯備液置於100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL的標準系列後等體積(10 μL)上機，根據其中一種色素的峰面積Y(mAU·min)為縱坐標，進樣濃度X(μg/mL)為橫坐標做標準曲線，得到酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O的線性回歸方程(表2)。酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O在2.5～12.5 μg/mL內均呈現良好的線性關係，r均大於0.999 8。

以空白值的標準偏差Sb以及校準曲線的斜率b計算出酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O的方法測定以3倍S/N計算檢出限，鹼性嫩黃O的方法測定檢出限為0.032 mg/kg，酸性橙Ⅱ的方法測定的檢出限為0.120 mg/kg。

表2 兩種非食用色素的線性範圍，回歸方程，相關係數及檢出限

Table 2 Linear ranges, regression equations,correlation coefficients and limit of detection of two inedible pigments

2.3 精密度實驗

將配製的0.1 μg/mL鹼性嫩黃O和0.2μg/mL酸性橙II標準品混合液10 μL注入HPLC系統。按1.3.3色譜條件連續反覆進樣6次(n=6)，結果表明酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O含量RSD分別為1.10%和1.19%，均小於1.2%，說明在該色譜條件下實驗設備具有良好的可靠性。

2.4 樣品加標回收實驗

取5種樣品的5.0 g空白樣品(腐竹、黃魚、榨菜、雞肉、辣椒粉)添加2種非食用色素標準混合液，標準混合液濃度依次為鹼性嫩黃O為5.00、7.50、10.00 mg/kg，酸性橙Ⅱ為6.00、8.00、10.00 mg/kg，每個添加量平行3份，進行加標回收率實驗，回收率、相對標準偏差如表3所示。

表3 不同食品中2種非食用色素的回收率及相對標準偏差

Table 3 Recovery and relative standard deviation of two inedible pigments in different foods

結果表明，3份平行樣品中，2種非食用色素在5類食品樣品中的平均加標回收率均大於80%，變幅分別為80.33%～90.47%(酸性橙Ⅱ)和80.17%～102.64%(鹼性嫩黃O)，相對標準偏差在0.8%～3.7%之間，該方法測定的結果比較準確。

2.5 重複性實驗

抽取5類樣品添加適量混標(腐竹、黃魚、榨菜、雞肉、辣椒粉)，分別每份取樣5次，按1.3.2方法進行樣品處理製備樣品溶液，各進樣10 μL測定，以酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O兩種色素的含量考察重複性，相對標準偏差小於2%(表4)。證明該方法具有良好的重複性，能夠滿足實驗要求。

表4 重複性實驗結果(n=5)

Table 4 Reproducibility of the method (n=5)

2.6 穩定性實驗

取0.1 μg/mL鹼性嫩黃O和0.2 μg/mL酸性橙II的混合標準品溶液，分別於0、1、2、4、6、8 h進樣測定，結果如表5所示。2種色素的RSD均小於1.2%，表明該HPLC方法用於食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O的檢測在8h內測定結果相當穩定。

表5 日內穩定性實驗結果

Table 5 Result of stability test in 8 hour

2.7 樣品驗證實驗

採用2.3的方法對市售的豆製品(包括腐竹、豆乾等)、肉製品(雞爪、真空包裝雞肉等)、鮮活類製品(黃魚、真空包裝黃魚等)、調味品(包括辣椒粉、豆瓣醬等)共40份樣品(見表6)中的非食用色素進行了檢測。

表6 不同食品中2種非食用色素的抽檢結果

Table 6 The sample results of two inedible pigments in different foods

註：「-」表示:未檢出。

結果在市售的辣椒粉中檢測到酸性橙Ⅱ含量為0.56 mg/kg，在市售的小黃魚中檢測到鹼性嫩黃O含量0.81 mg/kg，其餘樣品中未檢測出非食用色素。分析結果表明，建立的HPLC同時測定食品中酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O方法在20 min內即可完成2種非食用色素的同時檢測。本方法具有快速、簡便、實用性強等特點。

3 討論

3.1 不同提取條件的優化

提取溶劑的選擇對提取結果的影響至關重要。考慮各種溶劑的理化性質以及參考文獻[1,5-6,8]，選擇了V(甲醇)∶V(水)=70∶30、V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=55∶45(流動相)、乙腈、無水乙醇作為超聲波提取溶劑。對比結果表明，甲醇水溶液進行提取時回收率最高(其中腐竹中鹼性嫩黃O由流動相進行提取時最高，雞肉的鹼性嫩黃O回收率由乙腈進行提取時最高)，但是流動相和乙腈作為提取劑時所提取的雜質也較多，而且甲醇水溶液提取時2種非食用色素的總提取率最高，因此選擇甲醇水溶液作為樣品前處理條件中的提取劑。利用超聲波的空化效應輔助可為加快提取速度，實驗表明，萃取時間在15～20 min內能將不同類型的食品中2種非食用色素提取出來。隨著時間的增加，非食用色素提取效率有所降低，所以超聲萃取時間控制在20 min以內，同時超聲2次提取後提取量不再增加。而超聲溫度對食品中鹼性嫩黃O和酸性橙Ⅱ 2種非食用色素的提取影響並不顯著，說明2種非食用色素十分穩定。雖然採用甲醇水溶液在提取效率上較高，但是有的食品基質(如辣椒粉)中其他組分的干擾依然比較多,因此本方法將提取液上樣於SPE固相萃取小柱，效果十分明顯，有效去除了干擾雜質。此法利用SPE小柱中填料對提取液中成分的選擇性吸附或分配，並伴有分子篩效應，能夠很好的凈化和富集複雜樣品，類似於進行了一次色譜分析，故在食品樣品預處理中得到了廣泛應用[7-8]。

3.2 最佳吸收波長的選擇

對於2種非食用色素而言，其在對照品溶液中的最大吸收波長是不一樣的，紫外可見分光光度計對其對照品溶液和混合對照溶液進行掃描後發現，鹼性嫩黃O在430 nm處吸光值最高，酸性橙Ⅱ在480 nm時吸光度值最高，混合對照溶液在430 nm處達到最高。由於在色譜分析中的最佳吸收波長還受到流動相極性及pH等影響，可能發生紅移或藍移，因此在確定了最佳流動相後，再次在甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液為溶劑下調節檢測波長(435、440、445、450、455、460、465 nm)分別進行實驗，隨著波長的增加，鹼性嫩黃O和酸性橙Ⅱ的總峰面積不斷減少，但是酸性橙Ⅱ的峰面積不斷增加，考慮到酸性橙Ⅱ的響應值較低，因此在滿足2種非食用色素總峰面積最大的同時，也應盡量滿足酸性橙Ⅱ的峰面積較大。鹼性嫩黃O在450 nm之後，峰面積減少幅度較大，總峰面積減少幅度也較大，綜合考慮2種非食用色素的總峰面積以及單色素的峰面積，最終確認檢測波長為450 nm[16]。

3.3 流動相的選擇

對比V(甲醇)∶V(20 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,50∶50)，V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,55∶45,50∶50)，V(乙腈)∶V(10 mmol/L乙酸銨)=(75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,55∶45)3種流動相不同比例進行洗脫髮現，當選用甲醇-20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，調節流動相比例，酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O無法有效分離。在混合對照品進行分析時，在保留時間6.765 min左右始終有一雜質色譜峰出現，無法消除，可能與選用的對照品純度僅95%有關。當選用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，鹼性嫩黃O對照品溶液中的雜質還會形成多個色譜峰，雜質峰與鹼性嫩黃O的峰分離難度增加，而且在此流動相條件下，酸性橙Ⅱtm提前難以分離；當選用甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，發現其體積比為50∶50時，對照品雜質峰與酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O可以有效分離，而體積比比為55∶45時，酸性橙Ⅱ和鹼性嫩黃O出峰時間相對較早，易導致樣品雜質峰與目標峰的重疊，因此選用流動相為V(甲醇)∶V(50 mmol/L乙酸銨)=50∶50，在此條件下，峰型正常，無拖尾現象，且能與其他組分分離，理論塔板數和分離度均符合要求[16]。雖然梯度洗脫可以很好的解決多種組分分離的問題，本實驗經過多次優化仍然可以採用等度洗脫達到相同的效果，也提供了新的選擇。

HPLC simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods

LI Sha1，2,WANG Yin-hua1,3,YE Lin1,SHEN Guang-hui1,ZHANG Zhi-qing1*

1(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya』an 625014，China) 2(Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401120,China) 3(Sichuan Longchang Food and Drug Administration, Longchang 642150,China)

ABSTRACT：A method of HPLC simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods was established and optimized. The samples were ultrasonic extracted with solution of methanol: water (70∶30), and cleaned by C18SPE column. The chromatographic conditions was Kromasil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm), mobile phase methanol-50mmol/L ammonium acetate (50∶50).The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 450 nm, column temperature 35 ℃. The results showed the acid orange Ⅱand auramine O has a good linear relationship in the of 2.5-12.5 μg/mL, and the linear equations wasY=2×106X-1 240.1(r=0.999 9)andY=7×106X-5 284.2(r=0.999 6), with the limit of detection of 0.120 mg/kg and 0.032 mg/kg, respectively. The sample recoveries of five type food were 80.33%-90.47% and 80.17%-102.64%, respectively. Through the methodology evaluation and samples test. The method is simple and accurate with a good reproducibility. It can be used for simultaneous determination of acid orange Ⅱ and auramine O in foods.

Key words：food safety; acid orange Ⅱ; auramine O; HPLC

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703041

收稿日期：2016-06-23，改回日期：2016-08-26

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