這麼做實驗，想發低分都難

大家好，我是海明威，一個靠臉吃飯的男子，正好最近我聽說很多童鞋中了基金，而且不知道該怎麼花，如果你厭煩了測序晶元找lncRNA、circRNA功能實驗分子機制，想試試一些新的課題思路，不妨看看此文。

最近我沉迷於CRISPR的海洋無法自拔，因為別人家的CRISPR為何總能發高分，而我們卻只能用來做個基因敲除，灌水呢？我不服

CRISPR的基本作用除了基因敲入、基因敲除（Knockin、Knockout）外，還有基因干擾、基因激活、CRISPR高通量篩選（CRISPR/i、CRISPR/a、Screen）等，其在臨床疾病上的科研應用非常廣泛。

那麼今天海明威就跟大家分享一下CRISPR能發高分的技術思路。

（一）新功能基因CRISPR高通量篩選

這樣的工作量不小，但一般都是10分以上級別，當然也可以拆成幾個低分的發一發。

進行全基因組功能基因篩選的一般流程可以歸納為

1.科學問題提出（例：耐葯基因）

2.建立穩定的細胞模型

3.購買或構建文庫

4.製備含有文庫的細胞

5.用文庫細胞進行細胞模型實驗

6.細胞基因組提取，獲得sgRNA序列

7.測序獲得初篩基因

8.基因功能驗證

文章舉例：

【Cell】Genome-wideCRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis.

問題提出：發現腫瘤基因組中調控腫瘤生長、腫瘤轉移的相關基因

細胞模型：非小細胞肺癌(NSCLC)(KrasG12D/+;p53-/-;Dicer1+/-)；皮下注射（subcutaneoustransplant）

選擇文庫：mGeCKOa containing 67,405 sgRNAs（靶向20,611編碼蛋白基因；1,175microRNA）

圖：loss-of-function全基因組篩選腫瘤轉移相關基因流程示意

圖：驗證候選基因流程示意及實驗結果

（二）「閹割」的Cas9可做DNA抗體使用

將不具有核酸剪切活性的dCas9(deadCas9)與負責轉錄激活、轉錄抑制、表觀調控和熒光表達等蛋白相融合，可以實現對靶基因的轉錄水平及表觀遺傳的調控，或對特定的DNA序列進行熒光成像和實時觀察。

而這篇文章的作者，用「閹割」過的Cas9作為類似於抗體的特性，通過設計特異的sgRNA，將傳統的金黃色葡萄球菌（MRSA）檢測技術的時間大幅縮減到30分鐘，靈敏度提高了5倍，經濟成本居然還下降了，這樣的創新無論哪個雜誌都會喜歡的。

步驟如下：

MRSA病原菌基因組信息設計sgRNA裂解MRSA基因組成為裂解液sgRNA、dCas9和病原體裂解液混合通過Ni+磁珠吸附dCas9-sgRNA-dsDNA複合物用Sybr Green I熒光測定dsDNA濃度

（三）2017國自然中CRISPR項目

來看一下今年的CRISPR基金情況。

部分基金的標題一覽：

運用基因打靶和CRISPR/Cas9技術構建原發性膽囊癌小鼠模型，80萬；

利用CRISPR/Cas9高通量篩選技術研究超級增強子的功能，26萬；

利用報告基因和CRISPR/Cas篩選技術研究Wnt/β-catenin信號通路的下游調節機制，24萬；

利用CRISPR/Cas9系統對調控基因轉錄的順式元件及反式因子的高通量篩選和鑒定，26萬；

大規模CRISPR/Cas9基因組編輯研究幹細胞多能分化性，60萬；

基於CRISPR文庫篩查技術的絨山羊毛囊幹細胞增殖必需基因鑒定及功能研究，60萬；

基於含鉑高分子納米膠束的癌症CRISPR/Cas9基因編輯治療，63萬；

全基因組CpG-SNPs與早發胃癌發病風險及其機制研究，60萬；

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術實現F8在小鼠肝臟中的精準整合以治療血友病A，55萬；

基於非分裂神經元系統的CRISPR interference作用機制及應用研究，65萬；

TUBB8基因在卵子成熟障礙患者群體中的遺傳變異篩查CRISPR/Cas9介導的TUBB8突變小鼠基因治療研究，56萬；

應用CRISPR/dCas9技術介導miR-145調控間充質幹細胞定向分化治療老年ED的實驗研究，55萬；

運用CRISPR/Base editor技術調控Ku80分子跨核轉運研究hsa-miR-623抑制非小細胞肺癌轉移的機制，57萬；

基於CRISPR/Cas9技術研究鈉碘同向轉運體在甲狀腺癌放射性碘抵抗中的分子作用機制，48萬；

CRISPR-Cas9系統介導的脂肪幹細胞Sema3a表觀遺傳修飾用於促進2型糖尿病種植體骨結合的研究，56萬；

利用CRISPR/Cas9技術構建D374Y-PCSK9轉基因兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型，52萬；

新型CRISPR/dCas9介導的智能化基因線路精準治療膀胱癌的實驗研究，66萬；

應用CRISPR/Cas9技術阻斷偽狂犬病病毒潛伏再激活的研究，25萬；

CRISPR-Cas9介導的免疫卡控點基因敲除的EBV-CTL在EBV相關胃癌免疫治療中的應用價，21萬；

......

關注後獲取《科研修鍊手冊》1、2、3、4、5，基金篇、生信特輯

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！