腫瘤耐葯的新模式

今天和大家分享的是一篇來自nature的文章《Rare cell variability and drug-induced reprogrammingas a mode of cancer drug resistance》，即腫瘤耐葯的模式：稀有細胞變異和藥物誘導的基因重排。

Instruction：針對癌症中突變基因的靶向治療具有短期效應，但腫瘤細胞耐藥性的出現則成了影響其完全治癒的主要障礙。耐藥性可以來自於二次突變，但在某些情況下並不能找到明確的遺傳性原因，而這也增加了非遺傳性稀有細胞變異導致耐葯的可能性。本文揭示了在單細胞水平上，人類黑色素瘤細胞表現出深刻的轉錄變化性，從而預測哪些細胞最終產生了耐藥性。這種變異涉及了在數量極少的細胞中高水平表達的一類罕見的，半協調轉錄的耐葯標記物。藥物的加入誘導了這些細胞的基因重排，將臨時的轉錄狀態變為穩定的耐葯狀態。這種重排始於SOX10丟失介導的分化帶來新的旁路信號的激活，部分由轉錄因子JUN、AP-1、TEAD的活化介導。作者的研究揭示了獲得性耐葯的多階段性，為單細胞耐葯動態的研究提供了一個新的框架。作者發現其他細胞類型也散發的表達出許多相同的標記基因，這說明在稀有細胞亞群中存在著一個通用的表達程序。

下面，通過4副圖片，一起帶領我們了解這篇文章所要表達的內容。

Figure 1 Resistance tovemurafenib is not heritable, and pre-existingpre-resistant cells are marked by veryhigh expression of resistance genes.

作者首先建立了兩種模型（Fig.1a）：一種是基因突變模型，一種是臨時的非遺傳性模型，在遺傳突變模型中，細胞耐葯狀態是不能恢復為不耐葯狀態的，而在臨時模型中，細胞處於預耐葯和非耐葯狀態之間（預耐葯的定義為在加用藥物後可產生耐葯集落細胞）。然後通過Luriaand Delbrück』波動分析（Fig.1a）來驗證這個假說：如果耐葯是遺傳性的，那麼偶然的早期耐葯轉變就會在擴增過程中得到增殖，從而導致大量耐藥性集落；然而，如果預耐葯狀態是臨時的，那麼所有培養環境中的細胞都有同樣的機會形成一個耐藥性群落，而不可能形成大量的耐葯集落。在耐葯集落數量的分布中（Fig.1b），極端值的缺乏與遺傳性預耐葯表型不匹配。於是，作者開始思索，單細胞基因是否表達不同預耐葯細胞標記物。通過RNA測序（Fig.1d）確定轉錄過程與穩定耐葯的聯繫，找出了一些著名的耐藥性標記物，包括：WNT5A，AXL，EGFR，PDGFRB，JUN。接著，利用高通量單分子RNAFISH，發現一個稀有細胞集落在藥物治療前高水平表達耐葯基因（Fig.1c）。為了研究散發基因標記表達的的細胞是否最終會變為耐葯細胞，對EGFR-high細胞和EGFR-mixed細胞使用了3周的威羅非尼，發現EGFR-high組相比EGFR-mixed組產生的耐葯集落多出了7.9±0.92倍（Fig.1f）。將EGFR-high亞群放在沒有藥物的培養基上培養，發現在藥物治療前經過1周的培養，EGFR-high群落對比EGFR-mixed群落的耐葯克隆率從13.4±10.6降到了1.17±0.47，這表明預耐葯在這段時間內是沒有遺傳的。

Figure 2 Multiplex single-cell RNA FISH revealsrare cells with high, sporadic expression of resistance markers across multiplecell lines.

作者為了探究廣泛的散發性的表達是如何進行的，於是利用RNAFISH技術，將一組包括耐葯標記、管家基因和黑色素調節因子在內的19個基因整合到4000個細胞上（Fig. 2a）。通過基尼係數對AXL、EGFR、NGFR進行量化：代表所有細胞都有相同數量的mRNA分子，1代表1個細胞表達所有Mrna分子而其他的則不表達（Fig. 2b）。從圖上可以看出，在全部的23個基因中，有13個基因的基尼係數高於0.5，表明了一個很大的程度的不同。這其中，管家基因的基尼係數低於0.5，細胞周期標記CCNA2和慢循環標記KDM5B的基尼係數略微高於0.5（Fig. 2b）。這種現象擴展到三種其他黑色素瘤系、原始黑色素細胞和四種其他癌症類型（Fig. 2b），每個細胞系都有基尼係數非常高的基因，表明散發性表達既不是癌症也不是黑色素瘤所特有的。

Figure 3 Rare cell expression ofresistance marker genes is coordinated between genes, leading to cellsexpressing multiple markers.

由於許多耐葯標誌物分別表現出罕見的表達模式，作者想知道散發性表達是否在基因之間協調。高和低表達狀態的量化成對關係中，耐葯基因之間產生的比值率的範圍在4-142之間，表明高度的共表達 (Fig.3a,b)。作者發現兩組基因：管家和黑素細胞分化因子和耐葯標記物基因 (Fig.3b)。接著，作者提出假設，表達多種耐葯標記物的細胞更可能產生預耐葯。通過應用威羅非尼2周，發現EGFR陽性或NGFR陽性的細胞對比陰性細胞形成了更多的耐葯集落，而雙陽性產生了更高數量的耐葯集落(Fig.3c)。作者還發現這些標記物具有高階相關性，許多細胞表達高水平的多重標記，在這8672個細胞中，有13個同時表達6種標記物，有2個同時表達8種標記物(Fig.3d)。

至此，作者提出假設：耐葯的產生有兩個階段。首先，稀有細胞變為臨時的預耐葯狀態，然後添加藥物啟動細胞重編程，「燃燒」穩定的耐葯表型。

Figure 4 Vemurafenib induces stepwisereprogramming of preresistant cells into a stably resistant state.

為了確定添加藥物是否導致預耐葯細胞的重新編程，作者在用藥之前以及用藥後1周和4周分離出預耐葯細胞（通過分選高EGFR水平）。發現預耐葯細胞在接近耐葯激活水平上僅表現出非常小一部分的耐葯基因（72/1456）(Fig. 4a)。然而，在加入藥物後，耐葯基因的表達量增加了，用藥1周後，1456個總耐葯基因中的600個被激活到>80%，在第4周時增加到966個，表明在細胞變得穩定耐葯的過程中，轉錄組發生了人漸進的轉變。為了確定什麼基因調控變化維持這種重編程，作者使用ATAC-seq來識別轉錄因子結合位點(Fig. 4b)。比較非耐葯和預耐葯細胞，顯示僅有33個總體差異位點，這與臨時的用藥前預耐葯狀態與非耐葯狀態只有小的差異的假設相一致。然而ATAC-seq顯示在加入藥物後，這種模式中轉錄因子的佔有率發生了很大的變化。在未處理的細胞和用藥物處理4周之後的細胞之間的比較，失去了1787個和獲得了9143個易感位點(Fig. 4b)，顯示了廣泛的細胞重編程。由於SOX10整合的丟失導致許多初始峰值減少，而隨後的峰值增益來自TEAD和AP-1和其他信號通路的激活(Fig. 4c)。

在本文中，作者發現了一種導致耐葯的罕見的，臨時的狀態。他們的發現在概念上類似於Sharma等人的研究成果，這種發現可能不僅僅局限於黑色素瘤中；許多的這類基因在不相關的癌細胞表型（包括原發性，非癌性黑色素細胞）中顯示稀有細胞表達。這表明存在稀有細胞的表達程序控制耐藥性和潛在的表型轉換。進一步闡明可塑性和重編程可能為靶向治療開闢新途徑，包括脂質過氧化物酶途徑。

與此同時，瞬態耐葯和遺傳性耐葯的原因是並不互相排斥的。瞬時效應可能提供初始耐葯，使腫瘤細胞的一個小亞群存活，直到一些基因發生二次突變導致進展複發。在這種情況下，藥物的短暫應用可以防止重編程過程的完成，使細胞恢復藥物敏感狀態。作者的發現支持了這種間隔給葯策略。

參考文獻：Shaffer Sydney M,Dunagin Margaret C,Torborg Stefan R et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance.[J] .Nature, 2017, 546(7658): 431-435.

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