測序會取代晶元檢測CNV嗎？且看這篇研究

Introduction

DNA 拷貝數變異（CNV）在正常個體中佔據高達300Mb的變異數據，拷貝數變異的長度可達上百萬的鹼基對 。這表明不同個體間基因組的多樣性。目前已知一些CNV變異與人體疾病相關，如常見的DiGeorge 綜合征 (OMIM 88400),Angelman 綜合征 (OMIM 105830),以及神經發育缺陷疾病如ATR綜合征。

染色體微陣列分析chromosomal microarray analysis 即CMA（包括比較基因組雜交array-CGH和單核苷酸多態性晶元SNP-array）一直是檢測致病性CNV的金標準。與CMA相比，二代測序技術（NGS）則是一種可供選擇的檢測遺傳變異的高新技術，但其檢測解析度未知。近來，一些回顧性研究支持了NGS在檢測CNV上的可行性，但這些研究的樣本量均有一定限制。為研究全基因組低深度測序在檢測染色體數目及結構異常的診斷效率和可行性，我們應用了內部的CNV檢測方法對570例多中心患者進行了染色體分析。共有198例流產，37例死產，149例產前和186例產後樣本進行了檢測分析。

Materials and methods

分別收集早孕期流產的樣本及死產的胎兒組織，產前標本的絨毛膜組織，羊水及臍帶血，產後患者的外周血樣本。YH（炎黃，第一個重頭組裝測序的亞洲人基因組）淋巴細胞白血病細胞系也被用於方法學評估。所有樣本都經過質控。

CNV分析

1.質控和依據滑動窗口的假定CNV的篩選：對比序列依據比對基因組的位置分類進入長約50Kb且有5kb增度的可調整的滑動窗口。每個窗口的覆蓋度依據read數量進行計算並經過兩個步驟糾正偏倚（GC 校正及人群標準化校正）。對於質控，我們先去除了窗口中的染色體數目變異，接著計算了窗口拷貝比的基因組範圍內的標準差（GWSD）。經過兩部校正，如果樣本的GWSD

2.邊界確認及調整非重疊窗口的增益比：為了更準確的確定CNV的邊界，對其序列也被分類成了非重疊窗口。之後，對於任何特別調整的非重疊窗口（5kb），都計算出增益比，即為增益差除以覆蓋度。為了檢測最準確的CNV區域邊界，我們用circular peak-through篩查。同時還考慮重新決定片段或區域的平均拷貝數。

3.個體CNV注釋：當CNV的平均拷貝數比率小於0.9時，即定義為拷貝數缺失（嵌合體缺失突變：0.6-0.9）；當其平均拷貝數比率大於1.1時，則定義為拷貝數重複（嵌合體突變：1.1-1.4）

CNV分類方法基於ACMG（AmericanCollege of Medical Genetics and Genomics guidelines）變異指南，具體如下：

a. 致病性或可能致病性拷貝數變異（pCNV）：包含有GeneReviews定義的常染色體顯性致病基因；覆蓋於DECIPHER中已知綜合征的重要基因區域的50%；覆蓋有ClinvarCNV收錄的致病性CNV的全部區域或者包含有OMIM及HGMD同時收錄的基因；

b. 致病意義不明確的拷貝數變異（VOUS）：覆蓋ClinvarCNV中作為VOUS（致病意義不明確）變異的全部區域；或為缺失性突變且僅在OMIM/HGMD的任一資料庫有收錄；或包含有某些基因，但該基因是否存在於基於CMA資料庫（ClinvarCNV,DECHIPHER，及Baylor醫學院和中國香港大學的內部資料庫）收錄的計量敏感區域仍舊未知。

Result

為了評估全基因組低深度測序檢測CNV的有效性，我們通過與已知的CMA晶元檢測結果進行比較。68例包含不同CNV的DNA樣本（51例產前樣本，17例產後樣本）以及3例嵌合體致病性的CNV產前樣本被用於進行NGS檢測。NGS檢測結果及與CMA比較的結果如表1.

除了確認許多異常的CNV，我們的測序方法還在產前樣本中確認了42個長度範圍在1.3~69.1Mb的pCNV，這與CMA的檢測結果100%一致。在產後組中，我們的方法確認了9個長度在1.6~20.6Mb的pCNV,同樣與CMA的檢測結果一致。由此可見，NGS檢測pCNV的敏感性及特異性均為100%。

NGS還檢測到了6個嵌合體突變，其中4個為pCNV，與CMA方法檢測到的3個嵌合體pCNV樣本結果一致。在樣本HK12c637中，發現了一個2.9Mb的嵌合體拷貝數增加（約為40%的變異水平），該變異位於17p13.3(698057-3593612)，靠近一個拷貝數缺失（167kb）及拷貝數重複（517.5kb）的結合位點。在樣本HK12C0310中，我們的方法確認了一個位於5p15.33(684118–855103) 的約171kb的嵌合體缺失以及一個長度約為34.8Mb的嵌合體三倍體拷貝數變異，其位置在12p11.1p13.33(60105-34836577) ,兩種變異都在約50%的水平。第三個樣本HK12C0669，發現了一個位於染色體1q25.2q44( 179647508-249171049) 的終末端的嵌合體重複，而另一個終端嵌合體拷貝數的缺失則位於染色體4q34.3q35.2( 177543828-190910498) , 兩種變異都在大約50%的水平。整體來講，NGS在染色體數目變異及pCNV的檢測上和CMA方法有著一致性，從結果看，NGS方法的敏感性，特異性均為100%。

在評估了NGS的分子核型分析技術檢測pCNV的敏感性和特異性後，我們在自己的常規分子診斷實驗室應用此技術進一步評估它的實效。隨後，我們獲得了2013年1月到2015年3月間來自中國及香港的四個三級轉診中心地的570例樣本。這些樣本包括198例流產兒，37例死產兒，149例產前樣本及186例產後樣本。

測序分析在549例（96.3%）樣本中成功進行。在測序失敗的樣本中（21/570），10例為早孕期的流產兒，3例為死產兒，餘下8例是由於超聲檢測異常而終止妊娠的樣本。這些樣本的DNA質量都很低，很有可能是因為胎兒死亡造成的。總的來講，我們在549例樣本中確認了2411個CNV（790個拷貝數缺失，1621個拷貝數增加）。119例樣本確認有非整倍體變異，還有82例樣本檢測出共計104個pCNV（74個拷貝數缺失，29個拷貝數增加），整體診斷率為36.6%（詳見表2）。

在這些樣本中，NGS分子核型技術確定出11例患者有非整倍體的嵌合體突變，其中絕大多是早期流產兒（10/11），所有病例均通過熒光定量PCR排除了母系細胞污染的情況。

在549例NGS檢測成功的樣本中，我們從仍有足夠DNA樣本的368例樣本中隨機選取了25例進行CMA驗證。選取的樣本中包含有探針覆蓋範圍內的5個非整倍體變異（其中3例為嵌合體突變），13個pCNV。驗證提示，NGS的檢測結果與CMA的結果100%一致，這證明了NGS測序平台的高度一致性和可實施性。

Discussion

此研究用於探究NGS相比於CMA是否是一種更有效的檢測方法。在驗證組中，NGS的方法與CMA在檢測結構及嵌合體突變上的檢測結果完全一致。更重要的是，因全基因組測序的廣泛檢測及我們的演算法的較好解析度（50kb），我們還發現了CMA檢測未能發現的其他32個致病意義未明確的拷貝數變異。

在臨床檢測組中，NGS方法達到了36.6%的診斷率，提示了在遺傳診斷中約有1/2.7個人存在染色體數目異常或者結構異常。這種較高的拷貝數變異發現率可能主要是由於其在自然流產組中有較高的診斷率。然而，自然流產組別是染色體微缺失或者微重複分析在臨床診斷中得到較好應用的代表。對於死產的樣本組，由於樣本量較小（34例），相較其他先前的研究，樣本偏倚可能會造成本研究中觀察到的較高診斷率。不過不管怎樣，我們當前的數據都真實的顯示了一個較高的診斷率。對於產前和產後樣本組，NGS方法則有比傳統的三級轉診中心的核型分析技術更好的診斷率。除了非整倍體變異檢測，pCNV的檢出率在早期流產組，死產組，產前樣本組及產後樣本組的診斷率分別為6.4%，5.9%，13.5%，26.3%。與CMA相較，我們的方法在不同組別的診斷率均與其一致。

對於進行非侵入性檢測的產前樣本，從接受樣本到獲取診斷報告的周期為10天。基於HiSeq 2000的測序平台，一次可有多達96個樣本進行評估檢測（每次運行兩個），這將會降低患者的花費。通過DNA提取，建庫，及1500萬單向HiSeq 2000平台測序，每個樣本的花費大約為120美金。假設每個員工的薪金為每小時50美金，每次完成測序流程運行需要16個工時，則每例樣本的實驗員薪金應為67美金；所以，每個樣本的檢測花費約為187美金，與傳統的核型分析花費相比，這是絕對有優勢的。此外，對於不同樣本，NGS還能有更廣泛的染色體數目及pCNV的檢測，特別是在產前診斷中更有價值。

與CMA方法一樣，NGS檢測CNV的限制之一是對DNA有高質量的要求。因此，此方法可能不能完全應用於從死亡胎兒樣本中提取的DNA（6.4%，21/328樣本未能通過質控檢測）；更重要的是，不管是aCGH還是基於測序深度檢測CNV的低深度的全基因組測序都不能檢測三倍體變異。在本研究中，樣本ID 14S0026197通過SNP晶元技術確診為三倍體個體，但是我們的方法卻沒有檢測到此變異。而且，三倍體胎兒常常發生自熱流產，樣本通常無法檢測。排除以上限制後，我們提供了一種高通量的可信的通過全基因組測序發現染色體數目異常及CNV（特別是pCNV）的方法。

總之，NGS技術可以有效的用來診斷染色體疾病及微缺失和微重複綜合征。我們的研究證明NGS在產前和產後患者的檢測中，是一種能發現染色體數目異常及致病性CNV的高精準方法。更重要的是，我們的研究強調了NGS在產前或者產後樣本中確認傳統核型分析或者CMA分析未能發現的變異的潛在價值。

譯者介紹：

張倩倩，首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京市神經外科研究所在讀研究生，神經外科學，腦血管病方向；熱衷於NGS,目前從事NGS解讀變異與疾病診斷的相關研究

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