首次發現：外周血中異倍體循環血管內皮細胞CEC

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腫瘤病人外周血循環稀有細胞 (circulating rare cells, CRCs) 主要包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs) 和循環血管內皮細胞 (circulating endothelial cells, CECs)。CECs不僅與血管生成和腫瘤生長、播散有關，還能夠作為抗血管生成藥物的靶點和療效評估的標誌物。

CTC的染色體異倍體特徵及其臨床意義以往已有很多論述，而對於CEC的染色體倍體研究目前還沒有任何相關報道。最近，由國際著名的德國 Ludwig-Maximilians 大學醫學中心 (LMU) 、上海第一人民醫院腫瘤中心及賽特生物 (Cytelligen/Cytointelligen) 密切合作，應用SE-i?FISH^?整合技術，在共同完成的多瘤種、多中心的聯合臨床實驗中首次發現，腫瘤病人體內不僅存在染色體異倍體CTCs (CD31^-/CD45^- ) ，同時也存在著顯著數量的染色體異倍體CECs (循環腫瘤血管內皮細胞，CD31⁺/CD45^- )，以及「腫瘤上皮-內皮融合型細胞和癌栓」(tumor epi-endo fusion cells and clusters)。該研究不僅可以幫助人們進一步深入了解CEC在腫瘤血管生成與腫瘤生長、轉移過程中的相關性，更重要的是，使人們首次能夠有效區分、鑒別腫瘤病人血液中的異倍體CTCs及異倍體CECs這兩類完全不同的細胞。在極大地提高了CTC檢測的特異性同時，亦可同步對CEC的臨床意義，以及CEC與CTC如何相互協同等方面開展深入研究。該研究成果經Nature Biotechnology (自然?生物技術) 編輯部特別推薦，已發表在Scientific Reports雜誌上 (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)。

染色體異倍體CEC

染色體異倍體是惡性細胞的最典型特徵 (Kops et al., 2005 Nat Rev Cancer 5:773; Gordon, et al., 2012 Nat Rev Genet 13:189)。正常組織中的內皮細胞為二倍體，一般統稱為血管內皮細胞；腫瘤組織中的異倍體內皮細胞，定義為腫瘤血管內皮細胞 (tumor endothelial cells, CD31⁺/CD45^- ) (Hida et al., 2004 Cancer Res 64:8249)。循環內皮細胞CEC 在腫瘤血管生成及腫瘤轉移過程中具有極其重要的臨床意義 (Bertolini et al., 2006 Nat Rev Cancer 6:835)，然而以往對於外周血CEC染色體倍體的鑒別及相關臨床意義的研究則一直處於空白。本實驗研究人員藉助賽特SE-i?FISH^?及Metafer-i?FISH^?全自動六通道CRC掃描與圖像分析系統的特殊技術優勢，對腫瘤病人體內的CTC與CEC進行了系統性的檢測、鑒別與比較，首次發現了染色體異倍體循環腫瘤血管內皮細胞CEC的存在。文中大量研究證實，除少部分表達CD31⁺/CD34⁺(循環內皮祖細胞，CEP) 或CD31⁺/CD146⁺(成熟CEC) 外，大部分該類細胞具有未曾報道過的特殊蛋白表型CD31⁺/CD34^-/CD133^-/CD105^-/CD146^-/CD45^-。

進一步的研究發現，除異倍體CECs外，某些腫瘤病人體內還存在著異倍體epi-endo融合型腫瘤細胞及癌栓，且該類融合型細胞或癌栓具有迄今為止沒有報道過的獨特蛋白表型 (CD31⁺/EpCAM⁺/Vimentin⁺/CD45^- )。

異倍體CEC存在於腫瘤病人與正常人體內

進一步的臨床對照實驗發現，異倍體CECs 不僅存在於所有腫瘤病人體內，66% 受檢的正常人群 (n=47) 中也發現了該類細胞。但病人與正常人相比（6 ml 血液），無論異倍體CECs的陽性率 (腫瘤病人vs正常人: 100% vs 66%)，還是人均異倍體CEC 細胞數目 (腫瘤病人vs正常人: 8.8±14.3 vs 2.8±3.6, mean ± SD)，均呈現顯著性差異。

異倍體CEC在腫瘤病人與正常人群中的表型差異、功能的異同、以及循環腫瘤CEC在腫瘤生成、轉移等過程中的臨床意義仍有待進一步深入研究。

異倍體循環腫瘤血管內皮細胞CEC (CD31⁺ ) 與異倍體循環腫瘤上皮細胞CTCs (CD31^- ) 是兩類完全不同的細胞，且具有不同的臨床與生物學意義。隨著本文的發表，人們對這兩類細胞的認知日漸清晰，兩者絕不能再混為一談！顯而易見，對異倍體CECs與CTCs的有效區分與鑒別，已成為高特異性地準確檢測CTC的必要前提！

多重瘤標-iFISH

本文不僅向人們展示了獨特的SE-i?FISH^?技術用於同步檢測CECs 與 CTCs ，而且也為廣大腫瘤界同行提供了研究CTC上多重腫瘤細胞標示物的有效技術平台。藉助賽特生物與蔡司、MetaSystems聯合開發的Metafer-i?FISH^?全自動CTC圖像掃描與分析系統，5通道雙瘤標-iFISH及6通道三瘤標-iFISH將有助於人們研究、檢測CRCs上不同腫瘤標示物是如何與染色體倍體相互協同 ，從而在腫瘤轉移、耐葯、複發等過程中發揮重要作用。

SE細胞活性：

賽特生物CTC差相富集 (Subtraction Enrichment, SE) 與其它陰性富集方法的最大區別之一在於，SE富集避免使用低滲裂解法，而是使用本研究作者發明的特殊離心介質去除紅細胞 (Lin et al., 1999 J Cell Biol 145:279; Lin et al., 2009 Mol Neurodegener 4:1)，從而避免了低滲對CRC造成的損傷。本研究對經過SE富集及優化的液態免疫熒光染色 (Lin et al., 2000 PNAS 97:674) 後的腫瘤細胞進行了細胞活性評估。實驗結果顯示，經過SE富集及免疫染色，無論是腫瘤細胞還是殘留的白細胞，均保持了極高的細胞活性，存活率分別為95.3±2% (腫瘤細胞) 及 93±2.1% (白細胞) (mean ± SD)。差相富集過程及本文採用的免疫熒光染色方法對細胞活性的影響微乎其微。

實驗結果提示，SE富集CTC後，採用Hoechst標記細胞核，7-AAD 標記壞死細胞 (necrotic cell)，同時結合液態免疫熒光染色，可以為人們提供額外的技術手段，用於觀測腫瘤治療方法對體內CTC或體外培養的腫瘤細胞的殺傷效果，從而達到篩選腫瘤用藥及評估療效的目的。

SE CTC原代細胞培養、CDX腫瘤模型、腫瘤活細胞生物樣本庫

為了便於人們對賽特生物SE-iFISH的技術路線及各種應用有一個比較清晰的了解，本文將相關信息匯總成流程圖如下：

需要特別指出的是，SE富集分離出具有極高生物活性的各種體液來源 (如血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺等) 的腫瘤細胞可適於原代細胞培養。本文作者與美國加州大學聖地亞哥分校腫瘤中心 (UCSD Moores Cancer Ctr) 的聯合實驗證明，原代培養的腫瘤細胞純度在培養過程中明顯不斷提高，且可反覆凍融。這些培養的CTC原代細胞，或克隆化培養的具有不同臨床意義的CTC亞類細胞，可用於後續CDX腫瘤動物模型的建立 (Hodgkinson et al., 2014 Nat Med 20:897; Alix-Panabieres et al., 2016 Mol Oncol 10:443) 及腫瘤活細胞標本庫的建立。相對於石蠟包埋的病理組織切片，或單純的血漿蛋白、血漿核酸片段，SE富集得到的各種腫瘤細胞 (包括CTC) 不但具有生物活性，而且包含了完整的腫瘤細胞核酸與蛋白信息，從而為進一步開展腫瘤研究及建立具有真正意義與應用價值的「腫瘤活細胞生物樣本庫」(Biobank for Viable Tumor Cells) 奠定了堅實基礎。

i?FISHCTC單細胞測序

類似於腫瘤的高異質性，不同CTC之間也存在著極大的差異。藉助SE-i?FISH^?技術，根據染色體異倍體數目及腫瘤標示物的蛋白表達，對CTC進行亞類分型 (Lin, 2015 Clin Transl Med 4:38)，發現各個亞類的CTC具有不同的臨床意義，如腫瘤耐葯 (Li et al., 2014 Oncotarget 5:6594)、病人預後 (Li et al., 2015 Chin J Cancer Res 28:579) 等。對於今後開展CTC單細胞分析工作，顯然不再是隨意挑取檢測出的CTC，而是應針對性地挑取與不同臨床意義 (如腫瘤轉移、耐葯、複發等) 密切相關的CTC亞類單細胞。

多瘤種、多中心、多瘤標CTC臨床實驗及展望

目前國際上至少有22個多瘤種、多中心的CTC臨床實驗正在積極進行中 (Wang et al., 2017 Oncotarget 8:1884)。除CTC計數外，這些臨床研究更加關注與CTC相關的20個腫瘤標示物及與DTC相關的14個瘤標 (EpCAM, Vimentin, HER2 等) 蛋白表達的臨床意義。

隨著賽特生物SE-i?FISH^?技術的不斷普及應用，人們不僅可以在CTC上聯合檢測具有特定臨床意義的染色體異倍體及各種瘤標蛋白表達，同時還可以對循環腫瘤血管內皮細胞CEC的臨床意義進行深入研究。循環腫瘤內皮細胞CEC (Carmeliet & Jain, 2000 Nature 407:249)、腫瘤CEC細胞栓 (Cima et al., 2016 Sci Transl Med 8:345)、CTC癌栓 (Cheung et al., 2016 Science 352:167) 及Vimentin (Tsai & Yang et al., 2013 Genes Dev 27:2192) 在腫瘤形成、轉移、耐葯、預後、複發等過程中發揮著極為關鍵的作用。因此，在同一標本上同時完成對CTC與CEC的有效鑒別及檢測，不僅極大地提高了CTC檢測的特異性，同時可以幫助人們進一步探索CTC與CEC在腫瘤生成、轉移等過程中如何不斷相互協同，並發揮重要作用。

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