「特約文稿」艱難梭菌感染：臨床表型與細菌毒素相關嗎？

臨床表型與細菌毒素相關嗎？

艱難梭菌為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，為人類腸道正常定植菌，主要在人與人之間通過糞口途徑傳播，在腸道菌群紊亂時大量繁殖，繼而破壞腸黏膜屏障，導致以腹瀉為主要表現的一系列臨床症候群，為臨床最常見的條件致病菌之一。

【特約文稿】艱難梭菌感染：臨床表型與細菌毒素相關嗎？

陳燁 林倩雲

南方醫科大學附屬南方醫院消化內科

廣東省胃腸實驗重點實驗室（510515）

摘要：艱難梭菌（C.difficile）是院內獲得性腹瀉和偽膜性腸炎的首要病原體，產毒菌株主要通過產生毒素Ａ和毒素Ｂ引起腹瀉、腸道炎症甚至腸壞死。 有研究表明，C.difficile 在體內的產毒水平是影響C.difficile相關性疾病（CDAD）臨床表型的重要因素，而細菌毒素與臨床表型的具體聯繫尚不明確。 本文主要針對 ＣＤＡＤ臨床表型以及毒素蛋白的結構、功能及其調控等方面進行論述，探討細菌毒素與臨床表型的關係，為進一步深入研究C.difficile 的致病機制並探索新的藥物治療靶點奠定理論基礎。

艱難梭菌（Clostridiumdifficile,C.difficile）為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，為人類腸道正常定植菌，主要在人與人之間通過糞口途徑傳播，在腸道菌群紊亂時大量繁殖，繼而破壞腸黏膜屏障，導致以腹瀉為主要表現的一系列臨床症候群，為臨床最常見的條件致病菌之一。 正常腸道菌群可有效抑制C.difficile 的繁殖，而抗菌藥物等因素所致的菌群平衡破壞可導致該菌過度生長，致病菌株分泌毒素Ａ（TcdＡ， 腸毒素和細胞毒素）和毒素 B（TcdB， 細胞毒素），破壞腸道屏障功能，引起C.difficile相關性疾病（C.difficile-associateddisease，CDAD），其嚴重程度可自輕微自限性腹瀉至偽膜性腸炎、膿毒性休克甚至多器官衰歇致死。目前C.difficile已成為院內獲得性感染性腹瀉最普遍的病因，幾乎所有偽膜性腸炎均由C.difficile引起，並可導致患者平均住院時間延長，基礎疾病加重，死亡率顯著增加。此外，C.difficile 感染已被證實是炎症性腸病病情加重或複發的危險因素，而炎症性腸病的生物治療葯 物英夫利昔單抗又可增加C.difficile感染機會。CDAD已成為全球範圍內廣受關注的一個公共衛生問題。

C.difficile 的恆化培養和動物實驗研究已證實某些抗菌藥物能誘導C.difficile 生長及其毒素分泌，患者年齡、基礎疾病以及產生毒素中和抗體的水平是影響CDAD患病率、疾病嚴重程度和複發風險的重要因素。此外，菌株之間的差異，如產毒能力、隸屬不同血清組以及菌體表層蛋白質不同也可影響CDAD的臨床表現。 已有研究證實患者的腹瀉頻率、腹痛程度與糞便C.difficile 毒素水平相關，其受到細菌和宿主兩方面因素的影響。 本文主要討論C.difficile 毒素及其調控機制與臨床表型的關係。

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CDAD臨床表型

CDAD的診斷主要依據臨床表現（腹瀉、腸梗 阻、中毒性巨結腸）、產毒C.difficile 的微生物證據或結腸鏡檢查發現偽膜性結腸炎等。根據臨床癥狀和實驗室檢查結果可將CDAD分為以下幾種表型。

１．無癥狀攜帶者：無典型的C.difficile感染癥狀或體征。

２．輕度感染：只有門診患者發生的C.difficile感染才考慮診斷為輕度感染；表現為輕度腹瀉（ 不成形便 ３～５ 次／ｄ），無發熱，輕度腹部不適或壓痛，無顯著實驗室指標異常。

３．中度感染：非血性腹瀉，中度腹部不適或壓痛噁心，偶有嘔吐，脫水，白細胞計數＞ １.５ ×1010／L，血尿素氮和肌酐水平高於正常值。

４．重度感染：成人嚴重C.difficile 感染定義為發作時伴有一種或多種臨床表現／癥狀（表１）；兒童C.difficile感染的嚴重程度尚無統一定義。

５．複雜性C.difficile 感染：C.difficile感染髮作時並發中毒性巨結腸，因嚴重膿毒症入住重症監護病房，需手術治療或可能致死的臨床情況。

６．複發性C.difficile 感染：定義為前一次C.difficile 感染癥狀緩解後８周內再次發作。複發應與初始治療未獲緩解的遷延性腹瀉相鑒別，後者提示需尋找其他引起腹瀉的原因。 如無其他診斷，需考慮此類患者為難治性C.difficile 感染。 複發性C.difficile 感染常由與原來相同的菌株或其他C.difficile菌株再感染所致。 分子生物學研究已證實多達半數的複發性疾病是再次感染，而非原有菌株感染的複發。

7．難治性C.difficile 感染：定義為一線藥物治療３ ～ ４ ｄ 後無明顯的臨床改善。

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C.difficile 毒力因子

C.difficile 致病依賴於細菌產生的毒力因子，包括 細菌 染 色 體 致 病 決 定 區 （pathogenicity locus,Paloc ）編碼的毒素蛋白， 以及細菌黏附性、運動性等因素。C.difficile 產生的毒素主要作用於腸上皮細胞，毒素入胞並在胞質內激活，誘發上皮細胞壞死，進而導致腸黏膜完整性缺失， 宿主暴露於腸道微生物並激活一系列炎症反應。

１． ＴｃｄＡ 和ＴｃｄＢ

①蛋白結構和致病機制： 大 部 分 產 毒 菌 株 的PaLoc在C.difficile 染色體上的位點一致，可編碼５種毒素相關蛋白，變異菌株的PaLoc也可位於非典型區域。 由PaLoc編碼的毒素主要是大分子分泌蛋白TcdA和TcdB，包含４個同源結構域。 毒素蛋白 Ｎ末端包含Ｒｈｏ和Ｒａｃ葡萄糖基轉移酶結構域（ＧＴＤ），通過糖基化致宿主細胞質中的Ｒｈｏ和ＲａｃＧＴＰ酶失活，瓦解細胞骨架，破壞緊密連接，導致腸上皮完整性缺失。ＧＴＤ與半胱氨酸蛋白酶結構域 （ ＣＰＤ） 相 連，ＣＰＤ 在真核細胞質中與六磷酸肌醇結合，自催化裂解釋放ＧＴＤ片段，研究證實ＣＰＤ更高效的自催化反應可增加C.difficile 毒力。 已有研究發現了一種有效的半胱氨酸蛋白酶小分子抑製劑可阻斷ＧＴＤ 片段釋放，使ＴｃｄＡ ／Ｂ 毒力喪失。動物實驗表明該抑製劑的使用可減輕C.difficile 感染小鼠腸上皮的損傷程度，為C.difficile 感染的臨床治療提供了一個很有潛力的治療策略。ＴｃｄＡ和ＴｃｄＢ的另兩個同源結構域包括可嵌入宿主細胞膜的轉運功能區和梭菌重複寡肽序列（ＣＲＯＰ） 構成的受體結合區。 ＴｃｄＡ的ＣＲＯＰ區域包含多達３８個重複序列，可結 合 細 胞 膜 熱 休 克 蛋 白 ｇｐ９６和 碳 水 化 合 物。ＴｃｄＢ 的ＣＲＯＰ重複序列較少，ＣＲＯＰ片段完全缺失的ＴｃｄＢ在 較 高 濃 度 下 仍 可 表 現 出 細 胞 毒 性， 但ＴｃｄＢ 的受體是何種分子尚不明確。 有研究發現硫酸軟骨素蛋白多糖 ４（ＣＳＰＧ４） 可作為 ＴｃｄＢ的細胞受體，其Ｎ末端的胞外段可與ＣＲＯＰ片段以外的區域結合，但尚未見腸上皮細胞中存在ＣＳＰＧ４表達的報道。 近年來針對受體結合區以阻斷毒素與宿主細胞結合的藥物也在不斷嘗試中。

②基因變異與毒力改變：通過敲除不同毒力基 因繼而感染倉鼠，ＴｃｄＡ和ＴｃｄＢ在體內發揮的毒性作用逐漸被闡明。Ａ－Ｂ－菌株毒力完全喪失，幾乎不致病；Ａ－Ｂ＋菌株感染倉鼠的結腸病理評分較之Ａ＋Ｂ＋菌株無明顯降低，表明ＴｃｄＢ能單獨介導結腸炎症；ＴｃｄＡ的潛在作用尚存爭議，有文獻報道Ａ＋Ｂ－菌株不會引起結腸炎，但也有實驗證明ＴｃｄＡ可單獨介導腸炎發生。 這些不一致的發現可能與菌株、實驗動物及其微生物群組成以及抗菌藥物敏感性的差異有關。 綜合多個實驗室的隨訪研究顯示，ＴｃｄＢ是介導結腸上皮損傷、炎症和死亡的主要毒力因子，而ＴｃｄＡ是一個作用相對較弱的炎症反應驅動者，但其在倉鼠模型中的毒性作用較明顯。 不同C.difficile 菌株的ｔｃｄＢ基因序列存在顯著多樣性，據推斷毒素編碼序列的差異可能導致菌株之 間毒性的差異。從爆發流行的 ０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１菌株中提純的ＴｃｄＢ毒力是標準菌株的４倍甚至更高。 環境因素是否促進毒素多樣化、宿主環境的選擇是否增加或減少菌株毒性尚待研究。

③毒素的調控機制：ＰａＬｏｃ還編碼另３個調控蛋白ＴｃｄＲ、ＴｃｄＣ和ＴｃｄＥ。ＴｃｄＲ為 轉 錄 起 始 因子 σ，促進ＲＮＡ聚合酶與ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ啟動子結合。C.difficile 進入靜止生長期時，ＴｃｄＲ可啟動ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ基因轉錄；Ｃ．ｄｉｆ ｆ ｉｃｉｌｅ 進入對數生長期時，ＴｃｄＣ大量表達，可抑制ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ基因轉錄。已證實ｔｃｄＣ序列缺失與０２７ ／ＢＩ ／ＮＡＰ１ 菌株的高毒力有關，支持ＴｃｄＣ對毒素具有負向調控作用。然而在體外培養條件下，無論是敲除標準菌株的ｔｃｄＣ基因還是修復０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１菌株突變的ｔｃｄＣ基因都不能改變毒素分泌水平。 因此，ＴｃｄＣ對ｔｃｄＡ和ｔｃｄＢ基因表達是否具有確切的負向調控作用還需深入探究。

ＴｃｄＡ和ＴｃｄＢ缺乏傳統的分泌信號序列，目前一般認為ＴｃｄＥ與毒素的外分泌有關。 與其他 Ｃ．ｄｉｆ ｆ ｉｃｉｌｅ 毒素相關蛋白一樣，對ＴｃｄＥ介導毒素分泌的必要性一直存在爭議。 有研究認為 ＴｃｄＥ是介導毒素釋放不可或缺的蛋白， 也有研究證實在ＴｃｄＥ 完全失活的情況下毒素依然可以分泌。筆者等的研究發現，ＰａＬｏｃ中存在ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、ｔｃｄＲ、ｔｃｄＣ和ｔｃｄＥ五個基因連鎖突變的產毒菌株與臨床偽膜性腸炎的發生高度相關（Ｐ＜０.００１），並在機體內導致更嚴重的炎症水平（Ｐ＜ ０． ０５）（數據尚 未發表）。 檢測菌株是否存在毒素基因連鎖突變或許可儘早採取針對性預防措施，提前預防 ＣＤＡＤ病情惡化，有望為Ｃ.ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ 感染的控制提供更有效的手段。

２．二元毒素：一些C.difficile 菌株，尤其是高毒力的０２７ ／ＢＩ ／ＮＡＰ１ 菌株，除表達ＴｃｄＡ和ＴｃｄＢ外，還表達另一種毒素，稱之為二元毒素或C.difficile 轉移酶（ＣＤＴ），編碼基因位於ＰａＬｏｃ之外。ＣＤＴ的存在使患者死亡率明顯增高，是北美和歐洲的主要暴發流行菌株，我國也已發現０２７菌株，但並無證據顯示其有流行趨勢。ＣＤＴ包括兩個獨立的蛋白亞基，具有ＡＤＰ核糖轉移酶活性的ＣｄｔＡ能不可逆地解聚肌動蛋白細胞骨架；具有結合能力的ＣｄｔＢ能與宿主細胞結合，促進ＣｄｔＡ釋放至胞質。ＣＤＴ的核糖基化作用可干擾構成細胞膜的肌動蛋白網聚合，誘導腸上皮細胞微管突起形成，更多的纖連蛋白黏附至細胞表面，從而顯著增強C.difficile 黏附靶細胞的能力。 因此，攜帶二元毒素意味著菌株有更強的毒力。

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結語

歐美有C.difficile 感染的廣泛報道並對其進行長期監測和研究，亞洲對C.difficile 感染的研究相對較少，主要集中於一些發達國家或地區，如日本、韓國、中國台灣等國家和地區。 中國大陸各級醫療機構中，C.difficile 感染並不是一個需申報的感染。此外，限於技術和重視程度等原因，目前只有北京、上海、廣州等大城市的部分醫院或研究機構關注這一感染。 然而，隨著抗菌藥物的廣泛應用以及高毒力致病菌株的出現，近年來中國 ＣＤＡＤ發病率和死亡率不斷增高。目前，C.difficile 感染已成為基礎研究、公共衛生和臨床治療等多個領域廣為關注的問題，但其發病機制仍未完全明確，對於重症或反覆發作性病例缺乏確實有效的治療措施。 即使應用對C.difficile 敏感的萬古黴素或甲硝唑治療，仍有１５％ ～ ２５％ 的患者複發，目前對C.difficile 最為有效的藥物非達黴素治療的早期複發率仍可達８％，晚期複發率高達２０％ ，０２７型變異菌株複發率甚至高達５０％ ～ ８０％ ；而標準抗菌藥物治療易進一步加重菌群失調，引起感染複發。 因此，有必要探索新的C.difficile 感染治療模式。 研究C.difficile 的毒素結構、功能及其調控機制，將為在基因水平開發新的 干擾細菌毒素的藥物提供依據，為C.difficile 感染的臨床防控開闢一條新的道路。

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