-地中海貧血診斷指標：HbA2 檢驗標準化進程

地中海貧血（thalassemia）是最常見的單基因遺傳病，屬常染色體隱性遺傳，主要包括α-地中海貧血和β-地中海貧血。最新的流行病學調查發現，β-地中海貧血世界的平均流行率達 4.9%；我國廣西、廣東、海南三省高發，人群中的攜帶率為 1%-7%，其中重型β-地中海貧血的發生率達 0.4%。

糖化血紅蛋白 A2 檢測的臨床意義及存在問題

糖化血紅蛋白 A2（HbA2）作為診斷β-地中海貧血的指標，其重要價值在很久之前就被證實。在臨床工作中，僅僅利用輕微增加的 HbA2 值診斷是否為β-地中海貧血攜帶者仍存在一些技術難題。

由於隨機突變多樣性的存在，加之缺鐵性貧血或者δ-地中海貧血可能使疾病表型複雜化。基於在 HbA2 正常與異常值之間差別較小的緣故，在 HbA2 檢測環節做好嚴格的質量控制，對於準確診斷疾病、特別在遺傳諮詢時對夫妻雙方做風險評估方面起關鍵性的作用。

鑒於此，國際生化協會（IFCC）工作組在 2004 年成立，該工作組（IFCC WG-HbA2）致力於解決 HbA2 檢測的標準化問題。但到目前為止，對於標準化沒有一個完善的共識。

但有幾點意見已經提到議程：利用現代自動化的技術（如 HPLC、CE）確保準確性在±1%（變異係數為 2%），就結果的真實性而言要保證沒有偏差，總相對誤差建議控制在 7.0%，診斷介值為 3.6%（除外 MCV 和 MCH），如果考慮生物易變性的話，總誤差要求在 4.5%。

國際生化協會 IFCC 對標準物質的研發、參考範圍的確定等問題進行規範化管理，以提高其檢測標準化。發表在 Clinica Chimica Acta 雜誌上的一篇文章，對標準化進程進行綜述，該文章由義大利的 Renata Paleari 和 Donatella Caruso 等人完成。

目前 HbA2 檢測現狀

據文獻顯示，HbA2 診斷β-地中海貧血的截斷值在 3.3%-3.7% 之間變動。國外學者近期的大量研究證明：實驗室內部偏差在方法要求範圍之內，而在方法之間卻存在顯著性的差異，很明顯各類檢測方法還沒有達到完全的均一性。目前，HbA2 自動化檢測方法還沒有達到一個最佳的水平，實現方法的預期最佳狀態，還需進行更多標準化的工作。

制定參考測定程序  

在標準化管理進程中，一個很重要的工作是建立參考測定程序，包括檢測方法和報告方式，其中檢測方法主要建議採用液相色譜-電噴霧質譜（LC-ESI/MS）和同位素稀釋質譜法（ID-MS）, 報告方式採用百分比（%，HbA2 佔總血紅蛋白量的比值）。

推薦使用的檢測方法以完整珠蛋白鏈定量為基礎，除去了傳統方法中的消化環節，能避免胰蛋白酶鏈的干擾，兩種方法均在權威實驗室建立並得到條件的優化，工作組建立這兩種方法還主要用於驗證參考品性能，重新校準常規的方法。建立參考實驗室網路，利用這兩種不同並且獨立的操作程序顯示出獨特的優勢。

以通過認證的標準品驗證結果的準確性

在 HbA2 檢測過程中，通過認證的標準品（CRM）也是必要的, 相關機構明確規定要使用高溯源性的標準品---對於不同的測量方法，得到一致性高的結果。

對於 CRM 有一定的要求：首先，根據試劑的變動，CRM 應該有合適的參考值，並且該參考值通過不同的檢測方法驗證或者根據國際認可的參考測定程序（RMP）定義； 其次，CRM 應該有充足的均一性、長期的穩定性、與臨床標本具有可替代性（減少校準偏差）。

目前唯一受業內認可的標準品是世界衛生組織（WHO）國際參考試劑（89/666，NIBSC,UK），該標準品的 HbA2 值為 5.3%±0.07%，該標準品溯源到 25 年前，其在 HbA2 檢測方法上可替代性的特點已經引起質疑，而且在不遠的將來，其將被淘汰，因此 IFCC WG 部分成員和參考材料與測量研究所（IRMM）合作致力於新的 CRM 的研發。

新的 CRM 包括重新合成品和凍干形式。首批實驗證明，新的 CRM 包含正常的 HbA2 基質，並且總血紅蛋白（濃度為 129 g/L）、高鐵血紅蛋白（MetHb，1%）與新鮮血液中量基本一致。對新的 CRM 的穩定性驗證發現：重新合成的材料儲存在 4℃ 條件下，至少 2 周內 HbA2 量不會有變化；對於凍干形式的材料進行了 4 年多的研究，儲存在-20℃ 條件下，HbA2 量無變化，並且沒有檢測到降解產物或者氧化反應的發生，儲存在 4℃ 條件下，HbA2 量基本能保持 2 年的時間，但是可以檢測到 MetHb 輕微的增加（大約 6%）。

因此，對於標準品的長期儲存，應在-20℃ 以下條件。經過以上的驗證可以肯定新的 CRM 的應用價值：在 HPLC 和毛細管電泳技術前提下，應用於人體血液 HbA2 濃度的檢測。

考慮影響地中海貧血診斷標準化的因素

臨床醫生和實驗室專家經常會一起討論：哪些因素可能會影響地中海貧血診斷的標準化？先讓我們了解下關於糖化血紅蛋白（HbA1c）在診斷糖尿病上的標準化問題：在美國人口中的 3 百萬青年進行調查發現，排除糖尿病家族史，以 HbA1c 界值 6.5%（48 mmol/mol），發生率為 1.6%。

針對 HbA2，對 7 百萬人口的流行病學調查，HbA2 值在 3.3-3.7% 的範圍內，β-地中海貧血的發生率為 2%，說明 HbA2 在β-地中海貧血中的診斷中具有重要的意義，可見方法的真實性非常重要，在地中海貧血診斷標準化過程中，流行病學調查這一影響因素不容忽視。

在新的標準化指南出台之前，仍有許多的問題亟待解決：

1. 備選擇的測定方法至少需要在 3 個獨立實驗室得到性能驗證。

2.HbA2 標準物質至少包括兩個水平，並且至少能夠使用 5-10 年。

3. 生產廠家必須使用有證標準物質（CRM）驗證他們的方法。

4. 建立穩健的室間質評體系，保證實驗室檢測質量，並且為滿足臨床需要，建議確保 HbA2 測定的總誤差不高於 7%。

問題的解決不只是試劑生產廠家和檢驗人員的事，需要和政府、國際組織等共同努力。

β-地中海貧血診斷中，準確測定 HbA2 值至關重要。HbA2 測定的標準化對臨床醫生診斷疾病方面起著關鍵性的作用，因此 HbA2 檢驗標準化問題亟待解決。但 HbA2 診斷β-地中海貧血標準化指南的出台並不是一件簡單的事情，其不單單限於檢測這一環節，與β-地中海貧血診斷相關的事件，如地區流行率、家族史、產前診斷與遺傳諮詢等都應涉及。

圖片來源：https://pixabay.com/

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