看透一個細胞！科學家為研究單細胞代謝夯實技術

研究人員正在開發創新性方法了解個體細胞的內部工作機制。圖片來源：Torsten Wittmann/SPL

Renato Zenobi坐在一樓的辦公室里，這是一間通往牧場的工業實驗室。這位分析化學家解釋了細胞生物學家正面臨的一個基本問題。他在跟蹤代表理論細胞群中分子平均集中度的一條曲線—— 一條簡單的鐘形分布曲線。他解釋說，這樣的分布會隱藏複雜性。為了證明這一點，他畫了兩條與單峰的每一邊相重合的曲線，每個曲線代表群體中的一個典型表型，而且還與那個鐘形曲線相一致。「為了弄清楚這個分布是多峰還是單峰，你需要深入到單個細胞層面。」在蘇黎世瑞士聯邦理工學院（ETH）工作的Zenobi說。

細胞異質性是克隆種群中的一些細菌發展出抗菌素耐藥性的原因。它會導致大腦中產生不同的細胞亞種群，並解釋了腫瘤固態萌發。然而，監測這些不同點的工具才剛剛起步。

「目前的技術進步，尤其是那些過去兩年中的技術進步已經揭示了同一群細胞中的個體細胞可能存在巨大差異。」馬里蘭州貝塞斯達美國國立衛生研究院（NIH）共同基金單細胞分析工作組項目負責人Ananda Roy說，「這些不同會對健康和疾病產生重要影響。」

全世界的資助者都在排著隊支持單細胞研究。NIH從2014年開始投入了200萬美元，支持單細胞分析的特別計劃，目前該項目下屬的60個團隊獲得了獎勵。日本高校和公司合作啟動的單細胞測量員協會為單細胞分析和技術頒獎並舉辦研討會。2016年10月，專家討論啟動國際人類細胞圖譜倡議，該倡議旨在繪製每一種人體細胞及其特徵，這一雄心勃勃的任務極度依賴單細胞分析。

小而踏實的前進

分析單個酵母細胞讓Zenobi的團隊發現了潛伏在基因相同樣本中的兩個表型，一個叫作左旋糖1.6—二磷酸的低水平代謝物，另一個代謝物水平則較高。這一不同歸根結底可能是不同的葡萄糖使用策略。這一發現並沒有即時性的生物醫學應用，Zenobi說，但它卻照亮了細胞工作的基本方式。

為了得到這些信息，Zenobi的團隊利用精妙的技術分離細胞，提高其分析途徑的敏感性。Zenobi利用一種特殊的矽片，每個矽片可向質譜儀傳遞數百個單獨的細胞。對於肉眼來說，這些矽片似乎覆蓋著一層精細的網眼。這些網眼是叫作聚硅氮烷的一種聚合物外層，它經過激光微機械產生了數百到數千個儲藏庫，每個儲藏庫的直徑為兩三百微米。

Zenobi的研究生Robert Steinhoff展示了這些矽片如何適應一台質譜儀。研究人員利用基質輔助激光解吸/電離（MALDI）與飛行時間分析器相結合，這需要他們用化學基質驅動離子化。通過使用讓小分子生成的信號最小化的干擾矩陣，該團隊可以檢測到低埃摩爾範圍內（10~18摩爾）的代謝，這樣做時每個矽片約有1000個細胞，在單細胞世界中這一通量相對較高。

而伊利諾伊大學香檳分校分析化學家Jonathan Sweedler則研發了一種高通量方法，利用一台計算機將激光導向鋪陳在一個矽片上的單個細胞。該團隊通過這種方式可用每個矽片處理約1萬個細胞。但為了更綜合地觀看代謝機制，Sweedler每次僅分離一個細胞。他用一種經過修改的膜片鉗工具（它可以典型地記錄電子信號），從人類大腦細胞中提取了約3皮升的細胞質（相當於總量的10%~40%），並將其傳遞到質譜儀內。

這些有限通量使每次實驗的分析僅局限在幾十個細胞。儘管如此，Sweedler的團隊已經用它檢測了來自大鼠腦切片的30個神經元和星形膠質細胞的約60次代謝。該團隊聚焦諸如谷氨酸鹽等神經化學物質，還探測了氨基酸和三磷酸腺苷（ATP）的衍生物等。

不同大小 不同探測

在處理單細胞時，大小非常重要。植物細胞的直徑可從10微米到100微米不等。哺乳動物細胞傾向於更小，約為10~20微米。微生物細胞更小，可以達到亞微米級。由於細胞大小不同，代謝物的容量以及確切數字也會不同。「從分析視角來看，非常明確沒有任何單一的方法能夠應對這些容量。」華盛頓特區喬治華盛頓大學化學家Akos Verte說。他的實驗室利用不同方法分析不同大小的細胞。

對於最大的細胞來說，該團隊用銳化的光纖向細胞內直接傳遞紅外光。光纖刺激了氧—氫在細胞內的水中結合，導致細胞爆發，噴射出其內容物。這些溢出的物質會碰到一種霧化、電離的液體，即電噴霧，它可以使分子帶電進行質譜分析。這種技術的優勢是當單個細胞仍然鑲嵌在組織內時就可以被分析。但它可能非常緩慢，因為每個細胞通常需要「一名極有耐心的研究生」用纖維刺探，Vertes說。他近日利用一台計算機操控樣本台，將這一程序自動化。

最小的細胞被放置在一個納米柱覆蓋的表面，它也是用硅製成，儘管與Steinhoff的設備的製造方法不同。對整個表面成像揭示了該設備的離子束需要在哪裡靶向單個細胞。利用這種方法，該團隊能夠常規地探測飛克分子（毫微微克分，10~15摩爾）的代謝水平。但研究人員推測他們探測的更低限度是800仄普托摩爾（1仄普托摩爾等於10-21摩爾）或者約48.2萬個分子。

它甚至還可以到達更小的層面。瑞典哥德堡大學生物分析化學家Andrew Ewing分析了神經囊泡的小分子內容物。Ewing利用一種叫作納米級二次離子質譜分析（NanoSIMS）的方法，該方法用高能銫離子束轟擊一個樣本的表面。這一攻擊會驅逐表面的帶電粒子，它們可以通過質譜儀分析來決定物質的構成。Ewing團隊利用這種方法評估了神經囊泡多巴胺的分布。

在日本大阪理化學研究所（RIKEN）量化生物中心，化學家Tsutomu Masujima利用一段播放靶向用於質譜儀的單個細胞。「單個細胞的行為非常有趣和出乎意料，所以我喜歡儘可能多的看到它們。」Masujima說。

他的方法涉及在視頻觀察中向細胞內直接插入一個納米流噴霧針，吸出內容物，然後利用同樣的針將內容物注射到質譜儀中。加入視頻構成元素讓他的團隊可以完成更加精細化的操作，比如捕捉和分析氨基酸與血液中單個白血細胞和腫瘤細胞的脂含量。它還讓該團隊評估分子的豐富程度。

讓數據合理化

幸運的是，帶領加州斯克里普斯代謝組學和質譜分析中心的化學家Gary Siuzdak說，可以獲取生物信息學工具讓這些發現合理化。Siuzdak的中心經營了一家基於雲的代謝物分析平台，名字是XCMS在線，該平台的1.2萬多名用戶已經分享了超過12萬項工作。Siuzdak承認，那些工作中很少涉及單細胞，但這並不意味著它們天生的與那些軟體不相容。「在生物信息學方面，我沒有看到開展這些實驗的主要問題。」他說。

相反，單細胞代謝領域的主要挑戰是儀器：能有足夠研究單個細胞以及每個細胞代謝物的設備，這樣的研究結果在數據上才能有意義。「單個細胞的主要問題是硬體仍需提高。」Siuzdak說。研究傾向於分析數十個或是數百個不同的分子。但單個酵母細胞擁有約600種代謝物。因此，即便是最敏感的分析技術也只能選擇最容易探測的對象，最常見的是單個細胞內的分子。那些不常見的則處於雷達探測範圍以外。

該問題的一個潛在解決方法可能在於基於數量的工具和各種組學之中。「為代謝物數據集開發的通道和工具來自大量可再利用的細胞群。」他說。所需要做的全部是對研究人員使用的數據處理和歸一法的略微調整。「單個細胞轉錄組學已經建立了，我們可以從中學習加速針對單個細胞代謝物領域的生物信息學發展。」他補充說。

其他研究人員在追逐基於質譜儀之外的單細胞分析策略，特別是利用活體細胞。在談及單個細胞代謝物研究時，關鍵的技術挑戰已經被解決，Heinemann說。「現在需要做的是進行單調的開發和有效的工作」。

「我們經常會非常高興地探測獨特的分子，我的問題是為什麼要這樣呢？」Masujima問道，「這項發現的背後是什麼？這個分子為什麼會出現？」如果沒有這樣的洞察，技術會冒僅僅是賺取噱頭而不能解決生物學重要問題的風險。「我不想成為做這種科研的科學家。」他說。

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