引起數十億美元的專利案，深度解讀當今生命科學領域明星技術——基因魔剪

工欲善其事，必先利其器。方法技術從來都是科學進步的推動力，在生命科學領域更是如此。基因組編輯技術是通過人工核酸酶介導的基因組定點修飾技術。這種技術原則上能在任何物種基因組的任何位置上進行設計切除，從而能在內源性序列上引入特異性修改。人工核酸酶介導的基因組編輯（genome editing with engineered nucleases）技術入選2011年的Nature Methods最受關注的技術成果。2013年的Science、Nature Biotechnology等雜誌上，接連報道規律成簇間隔短迴文重複序列/規律成簇間隔短迴文重複序列關聯蛋白（clustered regularly interspaced palindromic repeat/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas）系統成為基因組編輯的一個簡單通用工具。這一系列基因組編輯新技術的研究和利用，進一步將靶向基因操縱推向高潮，使得多個基因敲除、敲入變得更為簡單、高效，將令動物育種、幹細胞定向分化、遺傳疾病定點修復等在未來數年內得到迅猛發展。

什麼是CRISPR/Cas系統？

CRISPR是指規律成簇間隔短迴文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat），Cas即CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated protein）。CRISPR/Cas9基因組編輯系統是由細菌和古細菌中存在的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統經人工改造而成。該系統介導的基因組編輯技術也叫做RNA指導的核酸內切酶（RNA-guided endonuclease, RGEN）系統。與ZFN和TALEN技術相比，該技術在設計、合成與篩選上更為簡便、快捷，具有極大的時間和成本優勢；不同於ZFN和TALEN技術的是，CRISPR/Cas9基因組編輯系統可以在一個細胞內同時進行多個基因的編輯，因此大大提高了對基因組的編輯效率。

CRISPR序列是由一個前導區（leader）、多個高度保守重複序列（repeat）和彼此完全不相同的間隔序列（spacer）組成，後兩者在前導區後交替出現，三者串連組成完整的CRISPR序列（圖1）。前導區長度通常在300~500bp，富含AT鹼基，在細菌的種內該序列非常保守，但在種間卻差異顯著。重複序列的長度一般在23~50bp，平均長度約為31bp。重複序列在同一個CRISPR位點中是高度保守的，一般只存在1~3個鹼基的差異。但是微生物種間，甚至同一種微生物的基因組上不同位置的CRISPR位點之間，重複序列的保守性卻是非常差的，序列差異很大。通過對目前已知的CRISPR序列中所有的重複序列進行分析發現，重複序列包含迴文結構，因此轉錄後能形成髮夾樣的二極結構，非常穩定。分布在重複序列之間的間隔序列一般由17~84bp組成，平均長度在36bp左右。間隔序列的保守性非常差，即便在同一個CRISPR位點中，也基本上沒有相同的間隔序列。重複序列的高度保守，間隔序列的完全不一致，實際上是與CRISPR序列的特殊功能高度相關的。

圖1CRISPR位點的結構圖

Cas蛋白的基因一般情況下位於CRISPR位點下游，但是有時也會分散分布在基因組中。Cas蛋白是實現CRISPR功能的重要執行者，是一個較大的多態性家族蛋白。目前對Cas蛋白的分類並不統一，其中一種是根據cas基因序列的保守程度，分為共有型核心cas基因、類型依賴型cas基因和重複序列相關未知蛋白（repeat-associated mysterious protein, RAMP）組件基因三類。

在這三種類型的cas基因中，共有型核心cas基因的蛋白質功能已經基本得到驗證。例如，Cas1和Cas2蛋白主要負責獲得新的間隔序列段。Cas3蛋白則具有解旋酶和核酸酶的功能，負責對目的基因進行剪切。類型依賴型Cas蛋白及重複序列相關未知蛋白的功能目前尚不明確，只有一小部分蛋白質功能已知。另外，很多Cas蛋白並不是單獨作用的，而是組合成複雜的蛋白複合體來發揮作用（圖2）。

圖2Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型CRISPR/Cas系統中的Cas蛋白 （改自Bhaya et al., 2011）

分別源於大腸桿菌（Escherichia coli）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）及嗜熱古細菌（Pyrococcus furiosus）三種類型CRISPR/Cas系統中共有的cas1和cas2基因標為藍色，每種類型獨有的蛋白質（Ⅰ型，cas3；Ⅱ型，cas9；Ⅲ型，cas10）標為紅色，紫色標記的蛋白質是類型依賴型Cas蛋白基因（如cas4、cas5、cas6、cas7）

CRISPR/Cas系統有哪些功能？

CRISPR/Cas系統所執行功能的發現，實際上得益於測序技術和生物信息的發展及大量病毒、細菌質粒序列信息的積累。CRISPR序列1987年就被發現，但一直到2005年才有研究團隊推測並證明了它的生物學功能。

CRISPR/Cas系統實際上是古細菌和細菌在長期進化過程中形成的特異性免疫系統，能夠以類似真核生物RNAi的方式為細菌提供免疫保護，特異性地阻止由噬菌體感染、質粒接合和轉化所造成的基因插入，因此也被稱為CRISPR干擾。CRISPR/Cas系統的作用過程主要包括3個階段：適應、表達和干擾。

以抵抗噬菌體感染為例。3個階段如下（圖3）。

1適應——新間隔序列的獲得

當噬菌體DNA進入基因組中帶有CRISPR系統的細菌內時，該宿主體內的CRISPR相關蛋白複合體會迅速與外源DNA結合，然後通過Cas1和Cas2等蛋白質的作用，將該外源DNA切割成長度在17~48bp不等的小片段，然後在相關蛋白的作用下，將其中的一個小片段整合至CRISPR前導區與第一個重複序列之間，形成一個新的間隔序列（圖3）。與這個區間同源的病毒DNA序列就叫做原間隔（proto-spacer）。

每一次插入活動都緊隨著重複序列的複製，進而形成一個新的重複-間隔單元。這樣就使得該細菌中的CRISPR位點中保存了此種噬菌體的序列信息，為適應性免疫奠定了結構基礎。並且研究發現，CRISPR系統里，宿主菌對噬菌體的抵抗力與CRISPR位點上間隔序列的個數相關。間隔序列的個數越多，宿主菌的抵抗力就越強。

2表達——表達並加工crRNA

CRISPR位點中，間隔序列所包含的信息能保護宿主不受特定噬菌體的攻擊。Kunin等的研究表明，整段CRISPR序列由位於前導序列末端的啟動子啟動轉錄，轉錄成包含多個重複序列和間隔序列的crRNA（CRISPR RNA）前體（pre-crRNA）。之後在核心蛋白Cas1-Cas4蛋白組成的蛋白複合物的作用下，pre-crRNA在特異性位點被剪切開，變成更小的crRNA，即成熟的crRNA。需要注意的是，被剪切開的特異性位點被認為是位於間隔序列的第8個鹼基處，但也有研究認為特異性位點是在重複序列上。

圖３CRISPR/Cas系統作用機制（改自Bhaya et al., 2011）

第一階段：新間隔序列的獲得。源於噬菌體或者質粒的雙鏈DNA被整合到宿主CRISPR序列的前導序列之後。CRISPR序列包含多個獨特的、被重複序列分隔的間隔序列（圖中標數字的彩色框，數字越大表明整合上去的時間越短）。間隔序列的獲得至少需要Cas1和Cas2蛋白的幫助。第二階段：表達並加工crRNA。pre-CRISPR RNA（pre-crRNA）被RNA聚合酶轉錄出來，經過Cas蛋白的加工，切割成小crRNA（圖中的髮夾結構，彩色部分代表間隔序列），每個crRNA包含一個單獨的間隔序列和部分重複序列。第三階段：crRNA破壞入侵核酸。crRNA包含的間隔序列與侵入的外源DNA（噬菌體或者質粒）配對互補，啟動由Cas蛋白進行的切割反應

隨後，crRNA與Cas蛋白複合物相互作用，組合成一個具有特殊功能的複合物crRNP（crRNA-Cas ribonucleoprotein），在下一階段發揮作用（圖3）。

3干擾-crRNA破壞入侵核酸

組合好的crRNP將會利用crRNA的匹配作用，在宿主體內尋找與其互補的噬菌體DNA片段，並與其特異性結合。此後蛋白複合體發揮作用，將噬菌體DNA雙鏈剪短，導致其降解，從而達到特異性地阻止噬菌體感染的目的（圖3）。需要特別指出的是，在識別外源DNA時，原間隔序列附近有一段被稱為原間隔相鄰基序（proto-spacer adjacent motif, PAM）的短序列，非常保守（圖4）。它在crRNA對外源基因的識別中發揮著重要作用，也是利用CRISPR/Cas系統進行基因組編輯必須遵守的規則。PAM並不是普遍的，有一些特殊的CRISPR系統不含有該基序。

圖4CRISPR/Cas系統的原間隔序列、間隔序列及原間隔相鄰基序（改自Bhaya et al., 2011）

A. 病毒雙鏈DNA（灰色部分）、原間隔序列（綠色部分）、PAM區（紅色部分）。 B. 新插入間隔區（藍色部分）的宿主DNA。C. RNA聚合酶轉錄的pre-crRNA（轉錄起始位點未顯示），以及成熟後的crRNA，橙色位置為成熟時的加工位點。D. crRNA與外源DNA完全匹配時，在原間隔內部啟動切割，這一過程中，需要CASCADE 複合體及Cas3蛋白。 E. 在crRNA與外源DNA不完全匹配時，切割不會啟動

CRISPR/Cas如何進行基因組編輯？

目前廣泛使用的CRISPR/Cas基因組編輯系統基本上都是Ⅱ型CRISPR系統。最為經典的Ⅱ型CRISPR系統中，包含4個基因組成的基因簇，分別是cas9、cas1、cas2及csn2。另外還有兩條tracrRNA 及多個間隔序列和重複序列相互間隔的CRISPR序列。Ⅱ型CRISPR系統對外源雙鏈DNA進行定點切割的過程分為以下幾步（圖5）。

圖5Ⅱ型CRISPR系統介導的DNA雙鏈斷裂（Cong et al., 2013）

1）CRISPR系統轉錄出pre-crRNA及tracrRNA。

2）tracrRNA根據鹼基互補配對原則與pre-crRNA形成二聚體，在相關蛋白的作用下，pre-crRNA被加工為成熟的crRNA。

3）成熟的crRNA-tracrRNA二聚體指導Cas9蛋白對外源基因中的靶序列進行識別。識別過程是通過crRNA上的間隔序列與外源DNA上的原間隔序列的互補配對，以及PAM區的輔助配對實現的。

4）Cas9蛋白中的DNA剪切結構域在外源基因固定的位置切開DNA雙鏈。

Ⅱ型CRISPR系統最先是由Jinek等開始改造，他們將crRNA-tracrRNA雙鏈RNA二聚體改造成單鏈嵌合體，並且改造後的單鏈嵌合體能夠發揮與雙鏈二聚體相同的作用（圖6），這條人工改造的單鏈RNA被命名為指導RNA（guide RNA, gRNA）。這一改造的出現，為人工構建CRISPR/Cas9系統並使用其進行基因組編輯打下了基礎。另外在該研究中，他們還發現Ⅱ型CRISPR系統中，Cas9蛋白包含的HNH核酸酶結構域負責切割外源DNA與間隔序列互補的鏈，而RuvC結構域負責切割外源DNA的另一條鏈。

圖6單鏈CRISPR系統（改自Jinek et al., 2012）

此後，CRISPR在基因組編輯領域中大顯身手，在很短的時間內，多個研究團隊都成功地將CRISPR /Cas9系統應用在了真核細胞中的基因組編輯中（表1）。與ZFN系統和TALEN系統相比，CRISPR /Cas9系統對於各種複雜程度的基因組都具有更高的修飾能力。另外，CRISPR /Cas9系統的構建更為簡單。而且Cas9蛋白可以方便地將核酸酶改造為切口酶（nickase）。只需要在Cas9蛋白中引入一個單氨基酸突變（D10A），核酸切割域的功能就變為切割單鏈DNA，能夠更精確地控制CRISPR /Cas9系統的打靶效果，大大降低脫靶的概率。綜合以上三方面，CRISPR /Cas9系統將會是基因組編輯技術的最有力的工具。

表1CRISPR/Cas9基因組編輯系統在基因組編輯方面的應用

CRISPR/Cas在人類細胞方面的應用

由於CRISPR/Cas9基因組編輯技術具有簡便、快捷的特點，科學家們也看到了它在技術應用上的極大潛力。在很短的時間內，CRISPR/Cas9系統就在多個物種的基因組編輯、基因表達調控等方面得到了大量的應用（表1、表2）。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術在人類細胞中的應用效果已被多個研究小組證實（表1）。這些研究涉及多種不同類型細胞（包括癌細胞和誘導性多能幹細胞）、多個不同基因位點（包括已經通過ZFN或者TALEN成功進行修飾的基因位點，如CCR5、AAVS1等）及各種修飾方式（包括基因敲除、同源重組、定點整合、多基因同時敲除等），充分說明了該技術在人類細胞基因組編輯中的強大作用。

麻省理工學院的Cong等最先利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術在人類細胞上實現了EMX1、PVALB雙基因的同時敲除，其中EMX1基因的敲除效率為27%、PVALB基因的敲除效率為7.3%；另外，通過同時導入靶向同一個基因的兩個不同位點的gRNA，實現了對EMX1基因的長度為196bp的片段刪除，刪除效率為1.6%。哈佛醫學院的Mali等在人類的誘導性多能幹細胞中實現了CRISPR/Cas9系統介導的基因組編輯。在他們的研究中，CRISPR/Cas9系統在人誘導性多能幹細胞中對AAVS1位點的打靶效率為2%~4%。

《動物基因組編輯》

作者：李奎 等

責編：李秀偉，白雪

北京：科學出版社，2017.3

ISBN：978-7-03-051243-7

動物基因組編輯技術是當前國際研發熱點。《動物基因組編輯》詳細介紹了動物基因組編輯技術的衍生和發展歷程，包括基因組編輯新技術及其原理、動物基因組編輯相關技術及其原理、基因組編輯動物安全評價原則及應用前景等內容。本書主要由工作在基因組編輯動物製備和培育一線的青年科技工作者編寫，他們結合國內外最新研究報道及切身的經驗和體會，結合基因組編輯動物製備和培育的實際案例，詳細介紹了豬等大家畜中基因組編輯技術應用的現狀、技術細節、成功經驗及發展趨勢。

（本期責編：李文超）

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