免疫球蛋白和T細胞受體基因克隆性重排兩種臨床檢測方法的比較

來源：中華病理學雜誌

作者：許潔，張科平，葛岩，顏黎栩，朱小蘭，庄恆國，劉艷輝（廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）病理科）

本文經《中華病理學雜誌》授權發布，其他媒體轉載或引用須經《中華病理學雜誌》同意，否則追究法律責任。

非霍奇金淋巴瘤是一種原發於淋巴結及其他淋巴組織的惡性腫瘤，克隆性免疫球蛋白重鏈（IgH）、輕鏈（IgL）基因重排被認為可作為B細胞非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）的輔助診斷方法；T細胞受體（TCR）基因克隆性重排則可作為T細胞非霍奇金淋巴瘤（T－NHL）的輔助指標。由於反應性增生的淋巴細胞為多克隆性來源，每個正常淋巴細胞的IgH/IgL和TCR的基因編碼均為多克隆性基因重排，而NHL起源於單個惡性轉化的淋巴細胞，所有的腫瘤細胞具有單克隆性的基因重排方式[1]。因此，準確了解基因重排方式能有效協助診斷。我們比較了聚合酶鏈反應（PCR）＋基因掃描法和PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法檢測29例淋巴細胞增生性疾病石蠟標本的IgH、IgΚ和TCRG基因重排結果一致性，目的在於找到操作簡便、敏感度高且準確可靠的方法應用於臨床檢測。

一、材料與方法

1.試劑與儀器：

基因重排檢測試劑盒（IgH3＋IgΚ；PCR毛細管電泳法，200001）、基因重排檢測試劑盒（IgL；PCR毛細管電泳法，200006）以及基因重排檢測試劑盒（TCRG；PCR毛細管電泳法，200008）由上海源奇生物醫藥科技有限公司提供；石蠟標本DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（56404）購於德國Qiagen公司；PCR實驗試劑盒為2×Go Taq Colorless Master Mix（Promega公司）；所有引物均由大連瑞真生物工程技術服務有限公司合成純化；丙烯醯胺、亞甲雙丙烯醯胺（Sigma公司）；去離子甲醯胺HIDI（ABI公司）；分子內標GS500Liz（ABI公司）；POP7膠（ABI公司）；基因擴增PCR儀為美國ABIVeriti公司；基因測序儀為美國ABI3500DX；Nanodrop2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀、垂直電泳槽（Bio－Rad公司）；凝膠成像分析系統（GBOX/XT－E公司）。

2.標本來源：

選取廣東省人民醫院病理科2011年至2015年保存的29例石蠟標本，均為手術切除標本，其中12例確診為B細胞淋巴瘤，8例為T細胞淋巴瘤，9例為淋巴組織反應性增生。

3.基因組DNA提取：

切取10 μm厚度組織8片，切片貼於乾淨的玻片上。二甲苯脫蠟至水後，按照HE染色片所選取的腫瘤區域小心用無菌刀片將腫瘤組織刮入1.5 mL的EP管中。應用石蠟組織DNA抽提試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取DNA。DNA利用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測其濃度及OD值，0.8%瓊脂糖電泳判定其質量。

4.PCR＋基因掃描法：

（1）PCR反應體系採用基因重排檢測試劑盒（上海源奇生物醫藥科技有限公司）包括：模板DNA至少100 ng；PCR預混反應液包括IgH管A（FR1－JH）、B（FR2－JH）、C（FR3－JH），IgΚ管A（Vk－Jk）、B（Vk－Ked＋intron－Ked），IgL（Vλ－Jλ），TCRG管A（Vλ1f, Vλ10－Jλ）、B（Vλ9f, Vλ11－Jλ），對照基因管（引物序列參照BIOMED－2研究結果[2]）；Ampli Taq Gold DNA聚合酶。各反應體系配製：PCR反應液16 μL＋Ampli Taq Gold DNA聚合酶1 μL＋DNA（包括待檢樣本、相應的陽性對照、空白對照） 3 μL。反應條件為：95 ℃ 7 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s共40個循環，72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。（2）基因掃描試劑配製：PCR擴增產物1 μL＋ LIZ500 0.5 μL＋HIDI 10 μL，變性條件：95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，將上述變性產物在基因測序儀上進行毛細管電泳。（3）結果判讀：對照基因管若在100、200、300和395 bp收集到ROX熒光信號，表示DNA的質量符合實驗要求，相應的陽性對照在有效的範圍內收集到不連續的熒光信號，而空白對照未收集除引物峰以外的熒光信號，如實驗滿足以上有效條件，落在有效範圍內的1或2個強陽性條帶的樣本提示基因重排為陽性，反之為陰性（圖1）。

圖1PCR＋基因掃描法結果圖

5.PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法：

PCR反應加樣體系：2×Go Taq Colorless Master Mix 12.5 μL，20 μmol/L引物（包括：FR1－JH，FR2－JH，FR3－JH，IgΚA，IgΚB，IgL，TCRGA，TCRGB，引物序列參照BIOMED－2研究結果[2]）各0.25 μL，模板DNA 100 ng，ddH2O加至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s共40個循環，72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。將產物於95 ℃變性5 min，4 ℃穩定一段時間後進行12%聚丙烯醯胺凝膠垂直電泳（恆壓250 V 65 min），銀染色，凝膠成像分析儀下觀察結果：於各自的有效檢測範圍內未出現單克隆條帶提示該樣本無相應基因重排；於各自的有效檢測範圍內出現單克隆條帶提示樣本中相應基因發生重排；陽性對照未出現單克隆條帶，陰性對照和空白對照出現單克隆條帶結果無效。內參基因出現條帶提示DNA保存完整（圖2）。

圖2PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法

6.統計學分析：

所有數據採用SPSS 16.0統計分析軟體分析，結果採用χ2檢驗，P

二、結果

1.PCR＋基因掃描法：

基因掃描結果顯示29例檢測石蠟標本中25例的基因重排結果與最終診斷相符合，4例結果與診斷不符合，該方法的檢出率為86.2%（25/29）。4例不符合病例中，2例T細胞淋巴瘤未檢出TCRG基因克隆性重排，2例反應性增生病例檢出TCRG基因克隆性重排。

2.PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法：

銀染色結果顯示29例檢測石蠟標本中18例的基因重排結果與最終診斷相符合，該方法的檢出率為62.1%（18/29）。11例不符合中8例（5例T細胞淋巴瘤、3例B細胞淋巴瘤）未檢測出克隆性重排，3例淋巴結反應性增生檢測出TCRG基因克隆性重排。

3.兩種方法的比較：

基因重排檢測結果見表1，PCR＋基因掃描法和PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法檢測結果的一致性達到75.9%（22/29），前者的檢出率為86.2%（25/29），後者檢出率僅為62.1%（18/29），χ2檢驗結果表明這兩種方法對IgH、IgΚ和TCRG基因重排的檢測結果差異有統計學意義（χ2＝7.177，P＝0.007）。

表1 兩種方法基因重排檢測結果

三、討論

正常情況下，淋巴細胞的免疫球蛋白（Ig）和TCR的基因結構是由可變區、多變區、連接區及恆定區組成，隨著淋巴細胞的發育，在重組酶的作用和機體調控下，這些基因片段重新排列組合，形成一個有結構的基因，這就是基因重排。腫瘤細胞無限制的增生，這種克隆性增生導致其獨有的克隆重排形式佔一定的優勢，這就是惡性淋巴細胞臨床克隆性檢測的指標，一旦某一克隆的淋巴細胞發生惡性變化，即可呈現特異的基因重排[3]。近年來開展的PCR法基因重排檢測技術，克服了傳統的Southern雜交存在操作繁雜、耗時長及需使用新鮮組織等缺點，廣泛被應用；分析技術目前臨床上主要為凝膠電泳異源雙鏈分析和基因掃描分析。凝膠電泳異源雙鏈分析根據PCR擴增後肉眼觀察電泳後產生條帶的特點來分析其克隆性，該方法主觀性強，容易受背景的影響而且不夠簡便直觀，其解析度不能達到精確區分的程度[4]；基因掃描可以產生清晰的峰圖，而且還能體現淋巴細胞應答中克隆增殖的情況，是一種十分靈敏和精確的檢驗手段，有著廣泛的應用空間。本研究結果顯示，相較於PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法，PCR＋基因掃描技術具有更高的檢出率，兩者之間的差異具有統計學意義。利用PCR＋基因掃描法與PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法分別檢測29例淋巴細胞增殖性疾病石蠟標本，4例結果與臨床診斷不符：2例淋巴結反應性增生病例經兩種方法檢測均檢測出TCRG基因克隆性重排，其中檢出TCRG－A基因克隆性重排1例，1例為TCRG－B基因克隆性重排，可能是由於TCRG基因的V區較少，重組方式少，會產生假克隆性信號；2例T細胞淋巴瘤TCRG均未檢測出克隆性重排，TCRG基因重排可出現在幾乎所有的T淋巴細胞瘤，其陽性檢測率可達94%，且結構相對比較簡單，故常用於T細胞的克隆性檢測，如果TCRG未檢出，可另外再測TCRB以及TCRD，以提高結果的準確性[5]。餘下25例中運用PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳法檢測仍有7例結果不符合，1例淋巴結反應性增生病例檢出TCRG－A基因克隆性重排，可能由於TCRG受體重排時連接方式的有限性，導致TCRG不同克隆之間基因擴增產物的長度差別很小，有時僅在1個或數個鹼基之間，普通的凝膠電泳很難將其區分開，容易造成假克隆性結果，本研究中所採用的PCR＋基因掃描法具有高分辨能力，可檢測出即使1個鹼基差異的基因擴增產物，可有效地避免假陽性結果的出現，與凝膠電泳異源雙鏈分析法相比具有明顯優勢[6]；餘下6例（3例為B細胞淋巴瘤，3例為T細胞淋巴瘤）均未檢出克隆性重排結果，分析認為，可能是在多克隆背景下，某些較小的單克隆群，由於與多克隆混雜，惡性單克隆細胞不能成為優勢，單克隆條帶淹沒在彌散或塗抹狀電泳中較難區別，而PCR＋基因掃描法高度敏感，可以探測到0.5%～1.0%的克隆性淋巴細胞，因此運用PCR技術及分析技術時，如何提高檢測的敏感性及正確區分單克隆和多克隆是淋巴瘤檢測的關鍵[7]。

總之，PCR＋聚丙烯醯胺凝膠電泳可作為克隆重排檢測的初篩，PCR＋基因掃描技術具有檢出率高，操作簡便等優點，對於淋巴瘤的診斷和鑒別診斷具有十分重要的意義。

參考文獻

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[3]KojimaK, KanedaK, YasukawaM，et al.Specificity of polymerasechain reaction－based clonality analysis of immunoglobulin heavy chain gene rearrangement for the detection of bone marrow infiltrate in B－cell lymphoma－associated haemophagocytic syndrome[J].Br J Haematol，2002，119（3）：616-621.

[4]張曉飛，周韌，毛崢嶸，等。B細胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排檢測及凝膠掃描技術應用的初步研究[J].中華病理學雜誌，2004，33（6）：513-517.

[6]WickhamCL, LynasC, EllardS.Detection of clonal T－cell populations by high resolution PCR using fluorescently labeled nucleotides; evaluation using conventional LIS－SSCP[J]. Mol Pathol，2000，53（3）：150-154.

[7]韋萍，周小鴿，余小蒙，等。IgH基因重排PCR分析在淋巴組織細針穿刺中的輔助診斷價值[J]. 診斷病理學雜誌，2008，15（1）：47-50. DOI：10.3969/j.issn.1007-8096.2008.01.014.

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