基於快速現場評價的診斷性介入肺臟病學標準取材技術

健康 05-22

基於快速現場評價的診斷性介入肺臟病學標準取材技術

馮靖1，周國武2，李雯3△，孟晨4△，周紅梅5△，李彩麗1，曹潔1

摘要：將快速現場評價（ROSE）技術與介入診斷有機結合，可構建完整的「基於快速現場評價的診斷性介入肺臟病學」體系。在ROSE輔助下，改變介入診斷操作的方式、方法和手段以獲取靶病灶，是該體系的核心環節。本文詳細介紹了「基於快速現場評價的診斷性介入肺臟病學」體系中最常使用的標準取材技術，包括雙鉸鏈刮匙操作技術、經支氣管肺活檢（TBLB）技術和經支氣管刷檢技術。
關鍵詞：細胞學；微生物學；病理學；放射攝影術，介入性；快速現場評價；介入呼吸病學
中圖分類號：R563

文獻標誌碼：A
DOI：10.11958/20170514

肺癌和下呼吸道耐葯病原菌感染患病率的增加，以及疑難病與呼吸危重症在診斷層面的迫切需求，促進了診斷性介入肺臟病學的蓬勃發展，使介入診斷能力成為評價一個呼吸或腫瘤中心綜合實力的重要參考指標。本文將詳細介紹「基於快速現場評價（rapid on site evaluation，ROSE）的診斷性介入肺臟病學」體系中最常用的取材技術，以及如何將這些技術與ROSE結合應用。

1
非經導向鞘雙鉸鏈刮匙操作技術

1.1　雙鉸鏈刮匙的技術參數　以CC-6DR-1（Olympus, Tokyo, Japan）為例：屬性為雙關節型；工作長度1 150 mm；適用工作孔道＞2.0 mm；插入部最大外徑1.5 mm；方向可旋轉；適用內鏡工作長度＜600 mm。

1.2　刮匙與防污染刮匙的技術優勢　(1)雙鉸鏈刮匙操作簡單，標本容易製片，適用於便攜支氣管鏡。其最大技術優勢在於可彎曲性和柔韌性，這使刮匙較容易進入「直型」活檢鉗或細胞刷因彎曲角度不及而不能進入的靶支氣管[2-3]。(2)刮匙插入部外徑1.5 mm，其先端外徑僅1.2 mm，且先端可彎曲。而普通細胞刷的刷毛蓬開後，其先端外徑可達2.5~3.0 mm。刮匙與防污染刮匙可到達比普通細胞刷更深在的亞段和更遠級別的靶病灶細支氣管、呼吸性細支氣管甚至肺組織。所以，刮匙與支氣管肺活檢(TBLB)標本的相關性和一致性就較好。(3)即使是非防污染刮匙，相比於普通細胞刷，污染口腔和中心氣道的可能都較小。普通細胞刷在工作孔道和氣道內行進中會沾染拖帶大量分泌物，形成污染。(4)如靶病灶鬆脆或壞死明顯，刮匙有時可獲得組織學標本，而普通細胞刷則不可獲得組織學標本。(5)較之TBLB，刮匙與防污染刮匙的技術優勢是併發症發生率低，可將氣胸、致死性出血、空氣栓塞等併發症的發生率控制在更低水平[3]，可輕鬆用於蜂窩肺、間質性肺疾病、輕度血小板減少或凝血功能障礙、珍貴兒以及併發症承受能力低下的患者，更適用於重症醫學領域，尤其是機械通氣中的患者。(6)作為一種細胞學載體，ROSE具備的功能包括：評價取材滿意度、實時指導介入操作手段與方式、形成初步診斷或縮窄鑒別診斷範圍、優化靶部位標本進一步處理方案、結合全部臨床信息與細胞學背景進行病情分析與轉歸預判[1]。而多數情況下刮匙與防污染刮匙在刮匙杯中颳得的內容為細胞學標本，肉眼見不到成形組織，決定了刮匙與ROSE或其他細胞學檢查結合使用可發揮更大的技術優勢。(7)刮匙取材具有較高的陽性率，在X線透視輔助下，其細胞學陽性率可達97.8%[3]；刮匙洗液所獲得的細胞學標本足以用於表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、Kirsten大鼠肉瘤反轉錄病毒原癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）和P53基因等的分析[4]。(8)就取材滿意度來講，刮匙處於TBLB和刷檢之間，術者應根據患者和病灶的具體情況選擇單獨或聯合使用TBLB、刮匙或刷檢。

1.3　非經導向鞘雙鉸鏈刮匙的操作　(1)調整內鏡方向與插入深度，盡量向靶支氣管深處部署，向靶支氣管開口及附近噴洒或滴注適量局麻藥物。(2)將內鏡退回中心氣道；助手調直刮匙，將刮匙送入工作孔道，術者推送刮匙直至其前出工作孔道，並於顯示器視及刮匙先端。應注意，與活檢鉗和細胞刷不同，刮匙先端圓滑，前出工作孔道出口時缺乏頓挫感，應在刮匙先端接近工作孔道出口時放緩推送速度，避免迅速前出損傷腔內黏膜或遠端肺組織。(3)前出刮匙全部可彎曲工作部，在腔內前進或後退並反覆彎曲刮匙，以調節並確認刮匙彎曲角度與朝向位置。(4)調整刮匙朝向點，將刮匙先端送入靶支氣管，先端一旦進入靶支氣管開口，助手即應伸直刮匙以利刮匙繼續向靶支氣管遠端深入推送。(5)盡量輕柔地向靶支氣管遠端推送刮匙至有阻力，再以韌力嘗試推送刮匙直至其不能再深入，注意切勿使用暴力，避免造成刮匙遠端組織損傷、氣胸或出血。在此過程中，如遇患者咳嗽較劇或呼吸動度過大，當暫緩進一步操作並回撤刮匙，同時採取噴洒或滴注適量局麻藥物、增加鎮痛鎮靜深度等應對措施。(6)確認刮匙到達靶支氣管最遠端不能再推進時，助手做輕度韌力的彎曲刮匙動作，使雙絞鏈刮匙先端前關節輕度彎曲。而後，術者以緩韌力量短距離回提和前送刮匙，反覆數次以完成刮取。(7)助手輕柔地伸直刮匙，術者緩緩回撤刮匙，於顯示器看到刮匙確實處於伸直狀態再撤入工作孔道並迅速回收。(8)應注意在所有伸直刮匙動作中，都切勿過度用力，以避免刮匙反張(過伸)。刮匙在工作孔道中前進或後退時，助手切勿做任何動作以避免刮匙打彎或反張而損傷工作孔道。(9)所有上述操作中，均應注意避免可能發生的標本污染。(10)可重複多次上述操作，在多次操作中，更應注意如標本污染可造成微生物培養假陽性。

1.4　刮匙操作中標本的留取　(1)應知曉在多數情況下，刮匙杯中颳得的內容為細胞學標本，肉眼見不到成形組織，但這並不影響細胞學製片和微生物標本的留取。(2)ROSE細胞學製片。回收刮匙，將刮匙先端抵於無菌細胞學專用玻片(須具較強細胞附著性)染色端1/3處，以無菌細注射器（2.5 mL或5.0 mL）針尖將刮匙杯中颳得的內容挑出並塗在細胞學專用玻片上，須薄厚適度。即刻交與助手進行ROSE染色。(3)組織病理留取。在組織鬆脆或壞死較多時，刮匙杯中可颳得肉眼可見的小組織粒標本，此時應以無菌細注射器針尖將刮匙杯中標本挑出，置於吸水紙上，福爾馬林固定，送檢組織病理。同時包括腫瘤學相關檢查，如免疫組織化學、聚合酶鏈反應(PCR)、染色體熒光原位雜交(FISH)、電子顯微鏡檢查以及微生物學相關檢查，如抗酸染色等。(4)在感染性疾病中，如颳得肉眼可見的小組織粒標本，可用無菌細注射器針尖將刮匙杯中標本挑出，直接塗於微生物培養皿上。如多次颳得組織粒標本，可將其集中一起，進行組織研磨培養；如不能颳得可見標本，可將刮匙先端在微生物培養皿上塗抹或置於少量滅菌生理鹽水中浸泡並抖動，並將該鹽水標本進行微生物檢驗。

1.5　防污染刮匙的製備與操作　(1)將刮匙套入無菌毛刷導管，用K201卡口(Olympus, Tokyo, Japan)將刮匙固定在導管內的合適位置，使刮匙先端距導管出口約5 mm。再以分析純高溫滅菌後的聚乙二醇4 000於約52 ℃封閉導管先端約3 mm，製成防污染刮匙，其後的操作要點大致同上。(2)防污染刮匙使用時，應注意將無菌毛刷導管和固定刮匙的K201卡口共同推送，前出工作孔道於顯示器看到導管先端後，後移K201卡口，固定導管，單獨推出刮匙，進行相應後續操作。(3)操作完成後，將刮匙收回導管內，推回K201卡口，仍將刮匙固定在導管內的合適位置，使刮匙先端距導管出口約5 mm；再將導管與K201卡口連同刮匙共同撤退回收；其他相應後續操作要點大致同上。K201卡口經消毒滅菌後可反覆使用。

2
常規（無X線透視輔助，非經導向鞘）經支氣管肺活檢技術

TBLB技術是診斷性介入肺臟病學中最基本、最常用，也是非常確切有效的操作技術[5-6]。基於ROSE的TBLB技術對以下肺部疾病（病變）的診斷或鑒別診斷有較大提示價值：(1)大部分常見類型實體惡性腫瘤。(2)結核病。(3)結節病。(4)部分支原體肺炎。(5)部分病毒性肺炎。(6)部分真菌，如麴黴菌、隱球菌、孢子菌及念珠菌感染。(7)機化性肺炎或機化性改變（即機化）或纖維化。(8)化膿性感染。(9)壞死性感染或壞死性改變（即壞死）。(10)部分變態反應性疾病或變態反應性改變。(11)部分免疫性疾病（如某些類型血管炎）或免疫性改變。(12)其他，如化療後免疫重建相關改變或肺移植術後相關改變[1]。TBLB安全性較高，大多可在非X線透視輔助下完成[7]。文獻報道其氣胸並發率可低至0.97%，需引流氣胸的並發率更低，僅0.55%，操作相關出血的並發率可低至0.58%[8]，而腦部空氣栓塞等其他併發症極其罕見[9-10]。

2.1　「馮氏六步法」常規TBLB技術的優勢　(1)常規TBLB原則上無需患者主動呼吸配合，但「頂住咬實」這一步(見2.2)盡量在患者呼氣相而非吸氣相進行。適用於兒科、全身麻醉、深度鎮靜與其他患者不能主動配合的情況。(2)操作中不追求突破感，良好掌握時，氣胸與致死性出血發生率極低；因為是在無突破感情況下取材，所獲標本既有肺組織，也包含部分遠端細支氣管黏膜和黏膜下組織，方便全面評價。(3)常規TBLB適合與ROSE集成使用，製得ROSE印片包含各層細胞內容，清晰明亮。染色後色彩鮮艷，分布均勻，容易判讀。集成ROSE後，常規TBLB得到實時質量控制和操作方式方法的實時修正與指導，以確保取材精確可靠，適可而止。(4)常規TBLB操作柔和、易學易用，高效安全，不僅適用於外周肺腫瘤性疾病的取材，更適用於外周肺感染性病灶標本採集。

2.2「馮氏六步法」常規TBLB技術的操作　(1)柔韌部署。經軟性支氣管鏡向靶支氣管部署鱷齒鉗（非圓杯平齒鉗），感覺或看到鉗頭前出工作孔道後，放慢前出部署速度，根據術前CT、虛擬支氣管鏡導航或手繪支氣管導航路徑，將鱷齒鉗送入靶支氣管開口，以一股柔韌的力量向靶支氣管遠端盡量深入部署。注意，不宜用過大力量，尤其不要用暴力，而用韌力，勿一味尋求突破感。(2)靈敏感覺。以操作手無名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控鱷齒鉗，以韌力緩慢地往複推進和回撤鱷齒鉗，耐心細緻地用指端去感覺鱷齒鉗先端頂在「如觸口唇」般的肺臟或「如觸鼻尖」般的遠端細支氣管（握住感），而非「如觸前額」般的遠端支氣管尖嵴。注意，如指端感覺為遠端支氣管尖嵴，應以韌力調整活檢鉗避開、滑過、更換靶支氣管亞段或重新部署。(3)往複開鉗。感覺鱷齒鉗先端頂在肺臟或遠端細支氣管後，助手以韌力做完全打開或部分打開鱷齒鉗的動作；此時，因遠端細支氣管從四周握住活檢鉗先端，鉗杯不易張開，術者應以韌力緩慢地往複推進和回撤鱷齒鉗，藉助鉗頭與周圍的摩擦力和空間以輔助盡量打開鉗杯；藉助往複開鉗動作，還可能將靶支氣管深部的細支氣管遠端部位（即鱷齒鉗先端以遠部位）的黏膜部分「撕裂」，從而暴露更多肺組織。注意，熟練掌握的術者可將該步驟與第2步合并完成。助手做開鉗動作要韌力而堅決，待術者做往複推進和回撤動作時，如鉗杯打開，助手應有相應的手上感覺。(4)頂住咬實。感覺鱷齒鉗鉗杯打開後，術者以操作手無名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控鱷齒鉗，以柔韌的力量向前頂住鱷齒鉗，使鉗杯「扣」嚴組織，助手以韌力堅決地咬實鱷齒鉗，盡量把組織咬入鉗杯。注意，該步驟原則上無需患者主動呼吸配合，但「頂住咬實」這一步盡量在患者呼氣相而非吸氣相進行。助手「咬實」時應盡量堅決，而不是單純的動作「快」。(5)緩韌撕扯。鉗杯咬實組織後，術者以操作手無名指抵住工作孔道入口，以拇指、食指和中指把控鱷齒鉗，以韌力後撤鱷齒鉗，體會所謂「手撕牛肉感」直至有「斷裂感」或後撤達一定距離，確認咬實的組織已被撕下。(6)回收標本。確認咬實的組織已被撕下後，助手應迅速回撤併回收鱷齒鉗，術者待鱷齒鉗完全退出工作孔道後應立即蓋嚴工作孔道封帽，仔細觀察並處理可能發生的出血。注意，迅速倒退回撤時必先確認咬實的組織已被撕下，避免形成暴力撕扯。在任何步驟中，如患者主訴相應部位有疼痛，都要終止操作。可稍回撤鱷齒鉗然後取材、更換靶支氣管亞段或重新部署鱷齒鉗。

2.3　常規TBLB操作中標本的留取

2.3.1　應優先滿足組織病理學檢查所需標本的質量和數量　(1)常規TBLB取材3~4粒，每粒取材均需ROSE印片。靶部位取材時，用一次性2.5～5.0 mL注射器針頭將組織粒從活檢鉗鉗杯中挑起，在基本不損失組織標本的前提下，在無菌細胞學專用玻片（須具較強細胞附著性）染色端1/3處自內向外塗抹出直徑約1 cm的圓形，須薄厚適度。然後，實時將印片交與助手進行ROSE染色與判讀，並將印片後的組織粒置於無菌吸水紙片上，放入預裝1.5 mL 10%福爾馬林的2 mL微量離心管，仍按常規方式送檢組織病理學。(2)根據ROSE判讀結果調整常規TBLB操作方式、方法。爭取即刻診斷，縮窄鑒別診斷範圍或結合臨床信息研判病情，不僅為臨床醫師制定診療方案提供重要參考，還可輔助選擇靶標本的下一步處理方式，包括腫瘤學相關檢查，如免疫組織化學、PCR、FISH、電子顯微鏡檢查等，微生物學相關檢查，如特殊染色、組織研磨培養等，並輔助選擇進一步操作手段。

2.3.2　組織學微生物培養　滿足組織病理學檢查取樣要求後，繼續取材進行組織學微生物培養。常規TBLB繼續取材2~4粒，每粒取材均需ROSE印片。然後，實時將印片交與助手進行ROSE染色與判讀（見2.3.1）；並將印片後的組織粒進行如下處理：(1)「組織研磨液」培養。置於無菌吸水紙片上，放入預裝有少量生理鹽水的1 mL滅菌微量離心管，送檢驗科行「組織研磨液」培養。(2)「組織增菌」培養。用一次性2.5~5.0 mL注射器針頭將組織粒從活檢鉗鉗杯中挑起，「塞入」一次性斜面型20 mL或60 mL注射器針頭內，然後將該「粗針」針頭刺入血培養瓶中，針頭後方用針筒空氣加壓，將該組織粒「吹入」血培養瓶。注意，染色後的ROSE製片如需用於其他檢測，例如FISH、免疫細胞化學、激光微俘獲等，應以無水乙醇脫色15~30 min。

3
經支氣管刷檢技術

3.1　二次防污染毛刷經支氣管刷檢術　以「馮氏防污染細胞刷（江蘇常州久虹/唯德康醫療器械有限公司）」為例

3.1.1　二次防污染毛刷的技術優勢　(1)雙套管設計，能較可靠地防污染[11-12]。內管與外管均處於完全封閉狀態，且內管與外管彼此間不交通。外管由封口薄膜封堵，內管一旦前出，封口薄膜僅松解而不會掉落。內管由共軸金屬頭封閉，藉助內管的彈性進行封堵，刷頭前出時即解除封堵；外管主要隔絕內鏡工作孔道內來自上呼吸道和主氣道的污染；內管與共軸金屬頭的封閉主要隔絕來自主氣道和段/亞段支氣管的污染。刷檢完畢刷頭回撤時，共軸金屬頭將刷頭封閉於內管，避免刷檢標本於回收毛刷時受污染。(2)兼容2.0 mm內鏡工作孔道，適用性強，能適配包括細軟性支氣管鏡（如BF-P-260F；Olympus, Tokyo, Japan）在內的多數呼吸內鏡，並可與虛擬導航和外周徑向超聲系統等設備結合使用，使刷檢更精確[13]。(3)作為細胞學載體，二次防污染毛刷的ROSE刷片具備全部細胞學功能，可評價取材滿意度、形成初步診斷或縮窄鑒別診斷範圍、結合全部臨床信息與細胞學背景進行病情分析與轉歸預判[1]；防污染毛刷獲得標本均為細胞學標本，決定了其與ROSE或其他細胞學檢查結合使用可發揮更大技術優勢。(4)刷頭細毛軟硬合理，取材量大，也比較適合細胞學製片。

3.1.2　二次防污染毛刷的操作　(1)封閉內管。撕去手環固定貼，一手固定內管手柄，另一手向後拉動手環，將防污染毛刷刷頭撤回內管內，藉助內管的彈性以共軸金屬頭封閉內管。(2)部署毛刷。經軟性支氣管鏡，將防污染毛刷整體部署到準備取材的靶支氣管的上一級支氣管，整體前出毛刷，於顯示器看到外管先端。(3)內管前出。一手固定外管手柄，另一手向前推動內管手柄，使內管先端突破外管封口薄膜的封堵，前出至外管先端之前至少1.5 cm。(4)部署內管。調整毛刷角度方向，固定內、外管手柄，使毛刷在內管前出的狀態下整體緩緩推進，依據影像學判斷或在虛擬導航、徑向超聲等的引導下，將毛刷整體送入靶支氣管開口，並將毛刷柔韌地盡量向靶支氣管遠端推送深入。(5)刷頭刷檢。一手固定內管手柄，另一手向前推動手環，使防污染毛刷刷頭前出，反覆推拉手環進行刷檢，完成刷檢後回撤手環，使防污染毛刷刷頭回到內管內，藉助內管的彈性以共軸金屬頭封閉內管。(6)回撤內管。術者固定外管手柄，留外管於軟性支氣管鏡工作孔道內，助手完全後撤回收內管和刷頭，留取標本。(7)隨棄外管。將外管抽出，回收，棄去。

3.2　超細細胞刷經支氣管刷檢術　以「馮氏超細細胞刷（天津亞森特醫療科技有限公司）」為例。

3.2.1　超細細胞刷（針刷）的技術優勢　(1)超細細胞刷，因其尖端極其纖細，又名「針刷」。其刷體導管外徑僅0.9~1.0 mm，內部盤旋導絲構成的刷頭先端直徑僅0.4 mm。對成人患者，針刷可部署至較為遠端深入的靶支氣管，稍用力部署時可非常深入。對兒童患者，可經內徑1.2 mm工作孔道的內鏡部署。針刷質地柔韌，較容易部署至雙上葉尖段等需要較大彎曲角度方能部署的葉段。(2)操作簡便，易學易用，便於普及，取材效果確切並安全，較之TBLB，針刷操作時並發需引流的氣胸和致死性出血的概率更低[11-12]。(3)針刷可部署至非常深入的靶支氣管，故其ROSE細胞學製片和種植培養皿微生物培養的效果應與TBLB接近，從而在一定程度上或可規避TBLB的風險。(4)作為細胞學載體，針刷的ROSE刷片具備全部細胞學功能，可評價取材滿意度、形成初步診斷或縮窄鑒別診斷範圍、結合全部臨床信息與細胞學背景進行病情分析與轉歸預判[1]。針刷獲得的標本均為細胞學標本，決定了針刷與ROSE或其他細胞學檢查結合使用可發揮更大的技術優勢。(5)採用聚乙二醇4000（聚乙二醇可在水中緩慢溶解，在乙醚或乙醇中不溶，溶點為50~54 ℃）。封堵針刷導管先端，可製成防污染針刷，再結合ROSE細胞學印片判讀與種植培養皿微生物培養，便於疑難病與危重症的評估和診治方案的制定[11-12]。

3.2.2　針刷的操作　(1)柔韌部署。經軟性支氣管鏡部署針刷，見到針刷先端前出工作孔道後即緩緩推進，依據影像學判斷或在虛擬導航、徑向超聲等的引導下，將針刷先端送入靶支氣管開口，並將針刷柔韌地盡量向靶支氣管遠端推送深入。注意，與TBLB活檢鉗（鱷齒肺活檢鉗先端堅硬圓鈍）不同，針刷先端纖細卻鋒利，易卡住而不能突入狹窄閉塞的遠端支氣管，向靶支氣管遠端推送深入時，切忌粗暴，須緩慢、穩健、柔韌地操作針刷；不推薦向閉塞的遠端支氣管強行推入，應知難而退，更換靶支氣管再試向遠端推送深入。(2)仔細感覺。術者以操作手無名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控針刷，以韌力緩慢地往複推進和回撤針刷，耐心細緻地用指端去感覺針刷先端頂在靶支氣管遠端的感覺，並體會其深度，以求盡量向靶支氣管遠端推送深入。(3)退後推刷。感覺到針刷先端頂在肺組織或遠端細支氣管後，術者把控針刷導管，將其回撤約0.5 cm；然後，助手緩慢、柔韌地推送針刷導絲使刷頭前出進行刷檢，完成後回撤導絲，收回刷頭。注意，針刷導絲先端纖細，推送刷檢時切忌粗暴，刷檢時僅做1次推送和回撤即完成刷檢。(4)回收針刷。回撤導絲，收回刷頭後迅速回收針刷，留取標本。

3.3　刷檢中標本的留取　針刷刷檢回收後可直接推出刷頭，留取標本。對二次防污染毛刷，僅回收內管，以無菌剪刀將導絲金屬頭連同部分內管先端一起剪掉棄去，再推出刷頭並留取標本。

3.3.1　刷片（塗片）　將刷頭推出，在無菌細胞學專用玻片（須具較強細胞附著性）染色端1/3處往複塗抹出約2 cm×1 cm的長方形，須薄厚適度。每次刷檢建議塗片3張。可多次刷檢以獲得3張以上的塗片。塗片可送檢以下項目：(1)第1張塗片應立即進行ROSE染色，並「迅速實時」轉到專用顯微鏡進行綜合分析（判讀）。因為製片、染色耗時極短，使ROSE判讀過程幾乎與介入操作過程形成實時反饋。細胞學判讀所獲印象是綜合分析病情時不可或缺的信息。(2)ROSE片基作為細胞學載體，不僅能用於細胞學判讀，其本身還是細胞得以保存和用於研究的寶庫。所有能基於細胞的分子生物學和基因技術均可利用ROSE片基得以開展，包括PCR、FISH、免疫細胞化學、二代基因測序等[1]。(3)送檢細胞病理學，行蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察細胞形態，綜合分析病情，亦可進行其他細胞學檢驗。(4)革蘭染色尋找細菌（球菌、桿菌）以及菌絲（絲狀真菌、假絲）和孢子等病原微生物。因為麴黴菌等絲狀真菌在下呼吸道很少定植，在影像學和臨床均符合時，經軟性支氣管鏡在防污染條件下取得真菌證據則高度提示感染而非污染或定植[14-15]。(5)特殊染色如抗酸染色（結核分枝桿菌、奴卡菌）、六胺銀染色（真菌）、過碘酸雪夫（Periodic acid-Schiff, PAS）染色（真菌）、氫氧化鉀（KOH）染色（真菌）、金胺O-羅丹明染色（結核分枝桿菌、奴卡菌）、乳酸酚棉蘭染色（真菌）等，以明確相應的病原微生物。(6)特殊染色如剛果紅染色（澱粉樣物）、油紅O染色（脂類），以明確相應的病因。

3.3.2　種植培養皿微生物培養　將推出的刷頭直接塗抹於沙保弱培養皿或血平板培養皿，行病原微生物種植培養。

3.3.3　刷頭洗液　用無菌剪刀將刷頭剪入預裝1 mL無菌生理鹽水的2 mL的微量離心管內，扣嚴封蓋，劇烈振蕩，將振蕩形成的刷頭洗液直接行病原微生物培養。或將刷頭洗液高速離心，將沉渣製片或用於細胞學檢驗。

參考文獻
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