臨床組學系列之一：口腔蛋白組學和宏蛋白組學研究

導讀

口腔中不僅有多樣性的微生物種群，也是病原菌的入口之一。口腔的穩態由唾液進行維持。因此，唾液分泌的變化以及口腔微生物種群組成的變化會導致許多疾病。此研究對唾液蛋白組進行了快速、深度的定量分析，為宿主和病菌互作以及臨床唾液診斷提供了基礎。

唾液蛋白組的深度定量

研究者們使用臨床常用的棉簽從四位男性及四位女性受試者中收集唾液。富集蛋白後，直接進行酶切，脫鹽，預分離，質譜分析，得到的數據使用MaxQuant及Perseus進行分析(Fig. 1)。

Fig. 1唾液蛋白組深度定量分析流程

在八位受試者中總共鑒定了54000條肽段以及5000+蛋白。其中78%的蛋白在所有受試者中都有鑒定到，90%的蛋白在至少六位受試者中鑒定到。而只有1.3%的蛋白是單個受試者獨有的(Fig. 2a)。即使是單個受試者，也鑒定了5213個蛋白。而且在所有蛋白中，丰度最高的15個蛋白只佔蛋白總量的32%，而在血漿和尿液中這個比例可達90%和58%(Fig. 2b)，這是唾液蛋白質鑒定數目如此高的原因之一。所鑒定蛋白的絕對丰度橫跨6個數量級，其生物學功能注釋如圖所示(Fig. 2c)。除了唾液，研究者還將受試者的血漿蛋白組進行了定量分析，發現在兩種體液中都鑒定到的蛋白之間的丰度值幾乎沒有相關性(R2=0.11;Fig. 2d)。由此可以得出唾液並不能成為血漿蛋白水平的替代物。

Fig. 2 8位健康受試者的唾液蛋白組深度研究

群組研究中的唾液蛋白組的動態變化

接下來作者對8位受試者的兩種狀態 - 睡醒後及餐後刷牙後的唾液蛋白組進行研究。PCA分析結果中，成分1可以按性別對所有樣本進行部分分離，而成分2可以按照上述兩種狀態顯著地分離各個樣本(Fig. 3a)。為研究PCA分布相關蛋白，研究者根據蛋白質丰度變化比例以及差異顯著性進行差異蛋白質篩選(Fig. 3b)，結果顯示睡醒後顯著上調蛋白多與「抗菌」及「抗微生物」相關，餐後上調蛋白多與「硫醇蛋白酶抑制」和「分泌」相關。

Fig. 3人唾液蛋白組的日內動態變化

人類唾液中微生物蛋白組的鑒定

因為口腔微生物對人類健康和疾病有著很大的影響，研究者們對唾液樣本中的微生物種類進行了鑒定。而由於親緣關係較近的細菌通常共享許多肽段序列，研究者將鑒定到的肽段置於一個分類樹上，這樣所有共享的肽段即可在每個分枝上表示出來(Fig. 4)。這個在門的水平上進行的微生物分類既可以保證肽段的鑒定和定量結果的可靠性，又無需使用過於嚴格的標準來鑒定細菌蛋白。

Fig. 4 50個細菌種屬的分類樹

微生物蛋白的存在是否干擾人源性蛋白定量結果的準確性呢？在本研究中，人和細菌共享的包含7個氨基酸以上的肽段只有0.043%(Fig. 5a)。因此，微生物蛋白對人源性蛋白的影響可以忽略。此外，與目前主流的MAILDI-TOF鑒定微生物的流程相比，shotgun蛋白組的方法足以直接覆蓋棉簽上的所有細菌蛋白。

口腔定量宏蛋白組

研究中同時鑒定到了如此多的蛋白讓研究者可以同時對微生物和人源性蛋白進行定量分析。鑒定到的人類蛋白有4000+，因此在所有6197個蛋白中，有至少三分之一的蛋白來自於微生物(Fig. 5b)。為了避免高估微生物蛋白質的丰度差異，研究者使用強度最高的10條（TOP 10）肽段的丰度之和來表徵蛋白質的含量。藉此，研究者們得出了丰度排名在前20個（Top 20）的微生物種類(Fig. 5c)。與16S RNA測序結果一致，鏈球菌是丰度最高的微生物。而排名前十位的微生物其丰度差異並不明顯。當把蛋白組的結果與人、微生物組的二代測序結果對比時，PCA分析顯示二者具有高度的一致性。表明口腔微生物組在個體中的差異並不明顯(Fig. 5d)。

Fig. 5微生物蛋白的定量分布

宏蛋白組的差異性和動態性

在不同受試者之間，微生物種類十分相似(R2=0.82;Fig. 6a)。而在所有受試者中，每個人的TOP 8的微生物的蛋白累積絕對丰度卻有很大的差異(Fig. 6b)，但相對丰度差異卻相對較小(Fig. 6c)。當把男女受試者分別進行累加的時候，兩組的微生物丰度卻十分相似且正相關(R2=0.94;Fig. 6d)。相反，在吃完早飯和刷牙之後，微生物丰度有著明顯的變化。高丰度微生物的含量降低2.5倍而低丰度微生物降低趨勢更明顯(Fig. 6e, f)。

Fig. 6不同受試者中以及時間點的微生物組成

本研究在人類唾液中一共鑒定到了超過5500個蛋白質以及超過50種微生物，且結果顯示鑒定到的蛋白質與NGS之間的定量結果一致性非常高，提示蛋白質組學可以作為微生物鑒定的一個有效補充手段，而且應用蛋白質組學對微生物進行鑒定，無需對微生物進行擴增培養，速度快，效率高。作者提出蛋白質組學是目前唯一可以在系統層面研究免疫系統與致病微生物之間相互關係的有效技術手段。

原文獻：

Grassl, N., et al. (2016). "Ultra-deep and quantitative saliva proteome reveals dynamics of the oral microbiome." Genome Med 8(1): 44.

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