抗腫瘤藥物的靶點分析及研發熱點

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來源：肖恩大俠

「條條大路通羅馬，每個靶點值萬金。」每一個藥物研發的靶點都可能是一個上十億上百億美金的重磅產品，當然，也可能是個研發的無底洞。本文簡要匯總了目前在抗腫瘤藥物靶點的一些基本概括、研究方向、主要熱點問題與趨勢等，供大家參考。此外，關於各靶點相關藥物的產品、公司、市場分析則可以更多線下探討。

導語

惡性腫瘤是危害人們生命健康的重大疾病，抗腫瘤藥物的研發任重而道遠。近年來，隨著腫瘤生物學及相關學科的飛速發展，人們逐漸認識到細胞癌變的本質是細胞信號轉導通路的失調導致的細胞無限增殖，隨之而來的是抗腫瘤藥物研發理念的重大轉變。

研發的焦點正在從傳統細胞毒藥物轉移到針對腫瘤細胞內異常信號系統靶點的特異性新一代抗腫瘤藥物。不同於傳統細胞毒藥物選擇性差、毒副作用強、易產生耐藥性等特點，靶點特異性抗腫瘤藥針對於正常細胞和腫瘤細胞之間的差異，達到了高選擇性、低毒性的治療效果，包括靶向酪氨酸激酶，血管新生，腫瘤細胞周期相關因子，組蛋白去乙醯酶抑制劑，微環境，腫瘤幹細胞，腫瘤代謝異常等。

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靶向蛋白酪氨酸激酶

(tyrosinekinase)

蛋白酪氨酸激酶是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，主要分布在細胞膜上，可分為受體型和非受體型，其功能都是催化ATP的磷酸基轉移到下游蛋白的酪氨酸（Tyr）殘基上，使其發生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶是一個龐大的體系，目前已經發現了100多種酪氨酸激酶，分屬20多個受體酪氨酸激酶家族和10個非受體酪氨酸激酶家族。

蛋白酪氨酸激酶在細胞信號轉導通路中佔據了十分重要的地位，調節著細胞的生長、分化、死亡等一系列生理生化過程。酪氨酸激酶的功能和腫瘤的發生、發展密切相關，超過50％的原癌基因和癌基因產物都是酪氨酸激酶，它們的異常表達通常導致細胞增殖調節發生紊亂，致使腫瘤發生。此外，酪氨酸的異常表達還與腫瘤的侵襲、轉移、腫瘤新生血管生成以及腫瘤的化療抗藥性密切相關。

基於近年來在基因組學、分子和細胞生物學以及生物信息學等學科取得的重大進展，越來越多的酪氨酸激酶被認為是很有希望的抗腫瘤分子靶點。目前有超過20個分屬不同家族的受體和非受體酪氨酸激酶被作為靶標進行抗腫瘤藥物篩選，包括表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮細胞生長因子受體（VEGFR）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）、成纖維細胞生長因子受體（FGFR）、胰島素受體（InsR）、Src、Abl等。靶向酪氨酸激酶的藥物分為抗體類和小分子抑制劑。

1998年，Genetech公司和Roche聯合開發的首個靶向HER2/neu的人源化單抗Herceptin被美國食品藥物管理局（Food andDrug Administration，FDA）批准用於治療某些HER2陽性的轉移性乳腺癌。首個上市的小分子酪氨酸激酶抑制劑是特異靶向Bcr-Abl的Gleevec（Norvatis公司），已先後被FDA批准用於慢性髓樣白血病（chronicmyelogenous leukemia，CML）和胃腸道間質瘤（gastrointestinalstroma tumors，GIST）的治療。從1998年至今，已經有包括bevacizumab（Avastin）、cetuximab (Erbitux)、geftinib（Irresa）、erlotinib（Tarceva）在內的8個單抗和小分子酪氨酸激酶抑制劑先後上市，超過100個藥物正在進行臨床研究。

最近，分子靶向抗腫瘤藥物治療又提出另一個挑戰性概念：多靶標酪氨酸激酶抑制（mul-tipletargeted tyrosine kinase inhibition）的策略。基於腫瘤發生髮展的複雜性，絕大部分腫瘤不是依靠某一條信號通路來維持其生長和存活的，信號通路之間存在著交叉和代償。多靶標藥物可以通過抑制多重信號通路或一條通路中上下游的多個分子而達到協同治療、克服耐葯的雙重功能。這一概念已經獲得了令人信服的臨床證據，兩個多靶點小分子化合物sunitinib和sorafenib最近已分別被FDA批准單藥用於腎癌。

其中sunitinib同時靶向VEGF-2和PDGFR、KIT和FLT3等多種酪氨酸激酶。而sorafenib一方面通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路直接抑制腫瘤生長；另一方面通過抑制VEGF和PDGF而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細胞的生長。另一個能同時抑制EGFR、VEGFR和RET酪氨酸激抑制劑Zactima（vandetanib）已獲歐洲罕見病藥品委員會（COMP）的批准推薦，用於髓甲狀腺癌。Gleevec在臨床應用中遇到的最大問題是易產生耐藥性，而第二代靶向Abl和Src激酶的雙重抑制劑對大部分Gleevec耐葯的腫瘤都有效。可以預見，多靶點聯合阻斷信號傳導將成為未來酪氨酸激酶抑制劑研發的新的發展方向。

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抑制腫瘤新生血管生成

(anti-angiogenesis)

靶向VEGFR、FGFR、EGFR等具有促進腫瘤新生血管生成作用的受體酪氨酸激酶抑制劑代表了抗腫瘤靶向藥物研究中另外一個重要方向——抑制腫瘤新生血管生成。自Folkman在20世紀70年代提出腫瘤新生血管生成的概念以來，靶向腫瘤新生血管生成的抑制劑研究已經取得了長足的進展，以Avastin為代表的腫瘤血管新生抑制劑得到了廣泛認可，目前已有包括我國在內的28個國家批准將該類抑制劑用於腫瘤臨床治療。

這些抑制劑的研發，都是基於對腫瘤新生血管的生成過程的認識：①腫瘤組織在很長一段時間處於休眠期，依靠組織滲透維持其生長。腫瘤長到1.0～2.0 mm3時，簡單的滲透作用已經不能滿足生長所需要的氧氣和營養物質以及代謝物的清除，瘤組織內部缺氧，缺氧誘導因子（hypoxiainducible factor，HIF）表達增強；②各類促血管生長因子如VEGF等表達上調，刺激內皮細胞活化，分泌血管生成所需的其它因子如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等，降解基底膜和細胞外基質，內皮細胞呈游離態；③游離的內皮細胞向刺激因子遷移，開始形成血管雛形；④內皮細胞在刺激因子作用下增殖；⑤內皮細胞重新排列組合呈條索狀，並刺激成纖維細胞分泌細胞外基質，形成新的血管。

針對上述過程的各個環節的抑制劑，都能不同程度的阻礙腫瘤血管的新生，減慢實體瘤組織生長速度。除了上文提到的靶向VEGF的單抗Avastin和小分子化合物sunitinib、sarafenib兩代酪氨酸激酶抑制劑外，內源性的新生血管抑制劑endostatin、interferon-β、2-metho-xyestradiol、tetrahydroco-rtisol等已經分別在臨床Ⅱ/Ⅲ期實驗，其中endostatin已經在我國上市。另外還有MMP抑制劑Marimastat（BB-2516）、AG3340、Neovastat以及抑制內皮細胞整合素αvβ3的單抗Vitaxin和小分子抑制劑EMD121947等正在進行各期臨床試驗。

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靶向細胞內的信號轉導分子

生長因子等細胞外界信號與其特異受體結合產生的刺激通過多條信號通路向細胞內傳導，構成了細胞內紛繁複雜的信號轉導系統，共同調控著細胞的增殖、分化。其中，由磷酯醯肌醇3-激酶（PI3K）和其下游的蛋白激酶B（PKB/Akt）、雷帕黴素靶體蛋白（mTOR）組成的PI3K-AKT-mTOR通路；絲蘇氨酸蛋白激酶Ras和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）三級級聯激酶組成的Ras-MAPK通路；以及下游信號轉導與轉錄激活因子STAT家族與腫瘤發生、發展密切相關，已經成為抗腫瘤研究的重要靶點。

PI3K是由脂類和絲/蘇氨酸激酶組成的一個龐大家族，包括數個磷酯醯肌醇激酶和DNA依賴的蛋白激酶如ATM、ATR和DNA-PK等。Akt是PI3K最主要的下游分子，前者可以激活包括mTOR在內的多個底物。mTOR分子被激活後，能通過磷酸化下游核糖蛋白S6激酶（p70S6K）和4E－結合蛋白（4E-BP）刺激細胞增殖、轉化並抑制凋亡。研究發現，PI3K-AKT-mTOR在廣泛的人類腫瘤譜中失調，該通路中某些基因突變所致的功能異常或缺失會引起正常細胞轉化，促進腫瘤細胞增殖和存活並介導腫瘤細胞的侵襲和遷移。

因此，PI3K-AKT-mTOR信號通路已經成為一個很有希望的抗腫瘤治療靶點。一些小分子抑制劑，如靶向PI3K的催化亞基p110的wortmannin、LY294002、IC484068和天然來源的PI3K抑制劑魚藤素（Deguelin）；抑制Akt激活所必需的絲/蘇氨酸激酶PDK的straurosporine、UCN-01和Akt的抑制劑perifosine；以及特異靶向mTOR的抑制劑雷帕黴素及其類似物RAD001、CI779和AP23573等已經分別進入各期臨床研究。

理論上來講靶向PI3K-AKT-mTOR信號通路的上下游三個分子都可以有效的抑制該通路，其中靶向上游分子PI3K或Akt最有優勢，一方面可以避免因抑制mTOR引起Akt的反饋性激活，另一方面可以同時阻斷Akt下游的多條通路，避免不同信號通路之間的代償作用。但是這一理論上的優勢並沒有在臨床試驗中得到證實，同時多條通路被阻斷後伴隨的毒性問題反而阻礙了其臨床應用。而特異靶向下游mTOR分子的雷帕黴素及其衍生物在臨床試驗中卻體現出較好的治療效果，並顯示出良好的開發前景。

Ras-MAPK通路由一組級聯活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，廣泛存在於各種細胞中，與PI3K/Akt通路共同肩負著將膜受體信號向細胞內轉導的任務，對細胞周期的運行和基因表達有重要調控作用。在多種腫瘤中都發現了該通路蛋白突變引起的持續激活，在腫瘤的發生過程中起到了重要作用。其中，Ras癌基因蛋白作為MAPK通路分子開關，可被包括EGFR、HER-2、VEGFR、PDGFR和MET等在內的多個細胞膜上的酪氨酸激酶受體激活，引發下游的級聯信號通路。

在各種腫瘤中Ras的總的突變率大約為30％，是人類腫瘤中突變率最高的基因。Raf是Ras下游最重要的蛋白，通過從胞漿中轉移到細胞膜上而被激活。Raf即MAPKK激酶（MAPKKK），屬於絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK級聯反應的第一個分子，它的磷酸化啟動了MAPK的三級級聯激活。Ras、Raf的相繼激活能活化下游的MEK、ERK等激酶，促進細胞的增殖同時還能通過磷酸化Bax、Bak抑制細胞凋亡。該通路在腫瘤發生、發展中的重要作用為抗腫瘤研究提供了多個潛在的靶點。

目前，針對上下游不同分子已經湧現出多個反義核苷酸和小分子化合物，其中最引人矚目的有影響Ras羧基末端功能的法尼醯基轉移酶抑制劑lonafarnib、tipifarnib（Zarnestra），以及上文提到sorafenib。該化合物最初被認為是Raf的抑制劑，後來發現對多個靶點包括VEGFR-2、Flt-2和c-Kit等都有作用。還有靶向下游蛋白MEK的PD0325901和ARRY-142886也已進入臨床研究用於黑色素瘤病人。

STAT（SignalTransducer and Activator of Transcription）家族蛋白是一組可以被不同的生長因子受體激活的蛋白，將上游的信號傳遞到細胞核，通過誘導靶基因轉錄表達引起不同的生物效應，並保持信號在細胞內傳遞的內在特異性。在多種腫瘤細胞以及原位癌中都檢測到了STAT家族成員的組成型激活。在STAT家族的7個成員中，目前發現STAT1、STAT3和STAT5與腫瘤的關係最為密切。STAT1對腫瘤細胞的增殖、新生血管生成起著負調控的作用，STAT1缺陷的小鼠易發生腫瘤。

與之相反，STAT3和STAT5的持續激活能上調凋亡抑制因子如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1及細胞周期調控蛋白cyclinsD1/D2等基因的表達，刺激細胞增殖、抑制凋亡，被認為是該家族中最有希望的抗腫瘤作用靶點。在白血病、乳腺癌、頭頸部磷癌等多種腫瘤中都發現了STAT3的組成型激活，並發現STAT3的小分子抑制劑或反義寡核苷酸可以逆轉惡性腫瘤的表現型，增加耐葯的腫瘤對化學藥物的敏感性。目前靶向STAT家族的反義核苷酸和小分子抑制劑的抗腫瘤藥物研發已經引起了廣泛關注。

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靶向細胞周期蛋白

細胞生長分裂必須依次經過準備階段的間期（interphase）和有絲分裂期（mitosis）。間期（包括G1、S、G2期）的各項生命活動保證了M期分裂時所需的細胞內各成分的複製，每次有絲分裂的結束到下一次有絲分裂的結束構成一個完整的細胞周期。細胞周期的運行與否，受控於精密的細胞周期調控機制。該調控系統的核心是一組細胞周期依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent-kinase，CDKs），它們各自在細胞周期內特定時間被激活，通過磷酸化對應的底物，驅使細胞周期的完成。CDKs的時相性激活依賴於時相表達的周期素（cyclin）以及周期素依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependentkinase inhibitors，CKI）控制。

另外，除了這種正常生理條件下的周期進程調控，在長期的進化過程中，細胞建立了一套保證細胞周期中遺傳信息的完整性和準確性的檢查機制，即細胞周期檢查點(checkpoint)。當細胞周期進程中出現異常事件，如DNA損傷或DNA複製受阻時，這類調節機制就被激活，及時中斷細胞周期的運行。待DNA修復或排除了故障後，細胞周期才能恢復運轉。

在細胞的癌變過程中，通常都伴隨著cyclin的過度表達和CKIs的缺失，CDK的活性失去控制，細胞周期處於失控狀態；腫瘤細胞的另外一個特點是細胞周期檢查點缺陷，造成對細胞損傷應答的缺失。然而，這種周期檢查點關卡的缺失，使得細胞對外界的損傷更加敏感又能被應用於腫瘤的治療，增加放化療的敏感性。基於腫瘤細胞的上述特點，恢復腫瘤細胞的周期調控和取消檢查點等都成為潛在的抗腫瘤作用靶點。具體策略包括對CDK的直接催化抑制，阻礙CDK的激活，干擾周期素與CDK的相互作用，影響周期素水解失活和抑制細胞周期檢測點等。

目前，已經有多個細胞周期的調節劑進入了臨床研究，其中植物來源的黃酮類物質flavo-piridol能明顯抑制CDK1、CDK2和CDK4，阻礙細胞通過G1/S和G2/M期檢測點，能抑制多種腫瘤細胞的生長，已經處於臨床Ⅱ期研究。另外，星型苞菌素（Stauros-porine）的類似物UCN-01除了抑制PKC外，還可直接抑制CDK1和CDK2的活性和細胞周期檢測點激酶chk1的活化，目前正在美國和日本進行臨床Ⅱ期實驗。還有Paullones類似物、嘌呤黴素類似物（Pruines）等都對不同的CDK分子顯示出抑制作用。

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組蛋白去乙醯酶抑制劑

(histone deacetylase inhibitor，HDACi)

腫瘤的發生和諸多基因特別是癌基因的異常表達密切相關，而染色體結構是調控基因表達的重要因素。通常情況下，凝縮的染色體會抑制基因的轉錄，而有轉錄活性的基因一般位於鬆散的染色體區域。染色體的基本單位核小體是由組蛋白（Histone）和DNA組成的，其中組蛋白的轉錄後修飾，包括乙醯化、磷酸化和甲基化能夠改變核小體的高級結構，進而影響著染色體的高級結構和基因的轉錄調控。細胞內一對功能相互拮抗的蛋白酶，組蛋白乙醯基轉移酶（Histoneacetyl-transferases，HATs）和組蛋白去乙醯酶（Histonedeace-tylases，HDACs）共同決定著組蛋白的乙醯化和去乙醯化。HAT可乙醯化組蛋白末端鹼性氨基酸的氨基，使核小體舒展，激活基因轉錄。而HDAC與之功能相反，抑制基因轉錄。

近些年的研究發現HDAC作為調控基因轉錄的關鍵蛋白酶，其功能異常與腫瘤的發生和發展有直接關係。當HDAC過度表達並被轉錄因子募集時，會抑制某些基因的正常表達。這種因HDAC活性過高引起的異常轉錄抑制在腫瘤中非常普遍，因此HDAC成為抗腫瘤藥物最具潛力的靶點之一。抑制HDAC的活性能引起組蛋白高度乙醯化，重新激活某些抑癌基因的轉錄並引起多項下游效應，包括促進腫瘤細胞分化、使腫瘤細胞阻滯於G1或G2期以及誘導腫瘤細胞凋亡，從而實現其抗腫瘤作用。另外，研究發現HDACi還能激活主要組織相容性複合物、細胞間粘附分子ICAM-1、干擾素Ⅰ/Ⅱ等分子的轉錄，促進免疫細胞的識別和激活。HDACi還能抑制缺氧誘導的VEGF表達，抑制新生血管生成。

來自真菌的TrichostatinA（TSA）是發現的首個能高效抑制HDAC的羥胺類天然產物，但存在著天然含量低、體內代謝不穩定的缺點。目前已經有10多個不同結構類型的HDACi進入了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，用於白血病和實體瘤的治療。這些藥物大多能在有效劑量顯示出較好的耐受性，並顯示出抗p－糖蛋白介導的多葯耐葯作用。

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靶向泛素－蛋白酶體通路

(ubiquitin-proteasome system, UPS)

蛋白降解調控是細胞信號轉導的一個重要方面，與基因轉錄水平的調控相比，這種轉錄後調控還能保證細胞在遇到外界刺激時更加快速的做出反應。UPS是真核細胞內依賴ATP的非溶酶體蛋白質降解途徑，負責調控細胞內多種蛋白的水解過程，其中包括許多調節細胞生長、信號轉導、基因轉錄和凋亡的重要分子。泛素介導的蛋白降解是一個複雜的多級反應，其過程主要是利用泛素活化酶E1、泛素結合酶E2與泛素－蛋白連接酶E3，將泛素連接至目標蛋白作為標識，並送至20S蛋白酶體進行降解，最後由泛素分解酶將泛素分解並回收再利用。

由於UPS通路與腫瘤的發生、生長和轉移都密切相關，該級聯反應中各個環節都成為抗腫瘤藥物作用的潛在靶點。例如，通過阻斷泛素分子C末端的腺苷酸化或與ATP分子競爭結合的策略來阻礙泛素的激活；根據E1與E2相互作用的結合域特異地設計能夠干擾其相互作用的小分子化合物阻礙泛素分子在E1和E2之間的傳遞等。其中特別值得一提的是靶向E3連接酶和其下游的蛋白酶體。

E1、E2和E3構成了金字塔形的級聯放大系統，最下游的E3通過識別不同底物決定著整個泛素化過程的特異性。抑制泛素連接酶E3的功能可以通過抑制其與上游E2或下游蛋白底物的作用兩條途徑來實現。目前還沒有發現針對E3和E2相互作用的抑制劑，但是對後者的研究已經取得了一些進展，其中最典型的例子就是MDM2對p53蛋白降解的調控。MDM2分子具有E3連接酶活性，通過泛素化調控p53的降解。

Nutlins是首個發現的阻礙p53和MDM2相互作用的小分子抑制劑，其空間構象和p53分子中與MDM2作用的氨基酸殘基非常相似，可以與p53分子競爭MDM2的結合位點。Nutlins在體內外都體現出抗腫瘤活性，對正常組織沒有明顯毒性。另外一個小分子抑制劑RITA早在1990年就發現其抗腫瘤活性，但在最近才發現其作用機理是與p53的N端結合，阻礙了MDM2對p53的識別，並穩定p53分子N端α-螺旋結構域。

E3連接酶下游的多個環節，包括蛋白酶體、參與泛素游離再循環的金屬異肽酶（metal-loisopeptidase）以及對多聚泛素鏈的識別等都可能影響UPS通路。其中，首個上市的以UPS為靶點的小分子抑制劑bortezomib（Velcade，PS-341）就是直接抑制於蛋白酶體活性。該化合物已先後於2003年5月和2004年4月被美國FDA和歐盟藥品審評管理局（European Agency forthe Evaluation of Medicinal Products ，EMEA）批准用於複發性和難治性多發性骨髓瘤的治療。最近FDA又批准其作為一線藥物用於已接受過至少一次治療的多發性骨髓瘤患者。進一步在血液系統腫瘤、實體瘤以及非霍奇金淋巴瘤中的應用正在研究中。

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靶向DNA損傷修復系統

除了上述直接影響腫瘤細胞增殖調控的信號通路外，特異靶向DNA損傷修復通路中的一些關鍵分子也成為抗腫瘤藥物研發的一個重要方向。很多傳統的抗腫瘤藥物包括烷化劑、DNA嵌入劑、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物等都是通過直接或間接造成不同形式的DNA損傷來實現其抗腫瘤作用。

在外界損傷的刺激下，細胞能啟動6條修復通路來分別應對不同類型的損傷：①直接修復（direct repair，DR）通路修復O6－烷基鳥嘌啉引起的損傷；②鹼基切除修復（baseexcision repair，BER）針對因氧化還原或烷基化引起的鹼基損傷；③核苷酸切除修復（nucleotideexcision repair，NER）修復因輻射、化學藥物或蛋白－DNA交聯引起的核苷酸水平的損傷；④鹼基錯配修復（mismatch repair，MMR）糾正鹼基錯配；⑤同源重組修復（homologous repair，HR）；⑥非同源的末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）通路，其中後兩條通路專門修復DNA雙鏈斷裂（DNA doublestrand breaks，DSBs）。這些通路的激活往往削弱了化療葯的抗腫瘤效果，成為產生耐葯的一個重要因素。

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靶向腫瘤基質細胞（微環境）藥物

1 成纖維細胞

成纖維細胞是最主要的基質細胞，癌相關成纖維細胞(CAFs)也被稱為活化的成纖維細胞或肌性成纖維細胞，其所分泌的基質衍生因子-1(SDF-1，又稱CXCL12)可直接刺激CXCR4+腫瘤細胞生長，還可募集CXCR4+內皮前體細胞(EPCs)參與腫瘤的血管生成。活化的纖維細胞通過SDF-1/CXCR4趨化軸吸引CXCR4+腫瘤細胞做定向遷移。

腫瘤原發灶所分泌的生長因子刺激「預轉移灶」內成纖維細胞、血小板衍生的生長因子受體陽性(PDGFR+)細胞和纖維連接蛋白增多，為腫瘤細胞增殖提供環境。在微轉移灶的缺氧環境中，活化的成纖維細胞可產生血管內皮生長因子A (VEGF-A)以促成血管生成，募集來的造血祖細胞(HPCs)也促進血管的生成。

腫瘤細胞與局部或遠處成纖維細胞之間通過旁分泌或內分泌而發生交互作用，腫瘤細胞通過這種機制調節腫瘤微環境並使遠處組織發生顯著改變。癌細胞分泌的白細胞介素-1（IL-1）、成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）和PDGF誘導成纖維細胞分泌肝細胞生長因子（HGF），HGF與癌細胞上的c-Met分子結合後能增強癌細胞的侵襲和遷移能力。另外，轉化生長因子-β（TGF-β）、表皮生長因子（EGF）、胰島素生長因子(IGF)和Wnt1等，是實現瘤細胞和基質細胞之間「對話」(cross-talk)的旁分泌信使。

2 浸潤的炎症/免疫細胞

腫瘤浸潤的炎症細胞是一把雙刃劍，除有一定的抗腫瘤作用外，更多情況下是在促進腫瘤的發生和發展。在眾多浸潤的炎症細胞中，以腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的研究最為深入廣泛。TAMs可通過分泌 FGF、HGF、EGF、PDGF和TGF-β等多種生長因子促進腫瘤生長。

單核細胞是TAMs的前體細胞，腫瘤產生的CCL2/MCP-1吸引單核細胞到腫瘤部位並分化為TAMs。腫瘤細胞、成纖維細胞、內皮細胞和TAMs都能通過產生CCL2、CCL5、CXCL8/IL-8和SDF-1進一步募集單核細胞。另外，CSF-1、VEGF-A和胎盤生長因子(PIGF)等也能引發單核細胞向腫瘤組織浸潤。缺氧介導的缺氧誘導因子-1(HIF-1)和VEGF也能吸引TAMs向腫瘤缺氧區集聚。纖溶酶原片段K1-3能阻斷TAMs的遷移和腫瘤對其募集作用。

TAMs不僅直接或間接地釋放血管生成因子來促進血管芽生，而且能夠產生一些酶來參與血管的重建。TAMs是VEGF-A的重要來源之一，還可通過分泌MMP來釋放細胞外基質(ECM)中被結合的VEGF-A。TAMs受缺氧和CSF-1等因素調節，缺氧使HIF-1和HIF-2調節的啟動子發生轉錄性活化，上調VEGF-A、MMPs、白介素和趨化因子。TAMs在破壞基底膜、引發癌細胞的遷移方面也發揮著重要作用。TAMs所分泌的MMP2、MMP9、TGF-β、uPA、tPA和組織蛋白酶等降解膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等ECM成分，進而促進腫瘤的侵襲和轉移。

3 未分化的骨髓細胞

在腫瘤生長的早期，VEGF-A和其他細胞因子能把骨髓中的內皮祖細胞(EPCs)動員到外周血，使之成為循環的內皮前體細胞(CEPs)並最終整合到新生血管的管壁上。腫瘤所分泌的生長因子和趨化因子會引起骨髓細胞增殖和向腫瘤內聚集。腫瘤細胞分泌的VEGF-A和PIGF等能把VEGFR-1+的HPCs和VEGFR-2+的EPCs募集到腫瘤的新生血管部位，促進腫瘤的生長和血管生成。

來自骨髓的造血祖細胞和未成熟的髓系細胞在SDF-1/CXCR4和CXCL5/CXCR2生物軸作用下被募集到腫瘤侵襲前沿，通過分泌金屬蛋白酶來增強腫瘤的外侵和轉移，並能促進腫瘤血管和淋巴管生成。CD11b+Gr-1+髓系抑制細胞（MDSCs）通過分泌抑制免疫反應的細胞因子、上調NO、產生活性氧族以及增強L精氨酸酶的活性而抑制免疫反應，引起腫瘤的免疫逃逸。

近來的研究發現，造血祖細胞能為腫瘤細胞在遠處的植入和增殖做好準備，原發灶所釋放的特殊趨化因子能動員一些未成熟的骨髓來源細胞(BMDCs)成群地植入到將要發生轉移的遠處靶器官內(圖1-1B)，分泌MMP-9等降解基質，使周圍環境更適合腫瘤的種植和生長。另外，BMDCs也表達CXCR4，通過與CAFs相互作用而增加SDF-1生成，進而吸引CXCR4+腫瘤細胞。

4 內皮細胞、周細胞和血小板

血管內皮細胞遷移、血管出芽是血管生成的主要模式。周細胞在PDGF-B作用下被募集到新生血管周圍，通過加強血管外側的細胞間緊密連接以維持血管的穩定性。血小板所提供的信號能夠引導BMDCs和瘤細胞的歸巢與滯留，血小板所釋放的SDF-1在募集和「挽留」CXCR4+的HPCs和EPCs方面起到關鍵作用，並趨化CXCR4+腫瘤細胞。穿梭在原發灶、轉移灶和骨髓之間的血小板不斷釋放大量的細胞因子，從而把這些部位連接在一起。

5 趨化因子及其受體與腫瘤的生長和轉移

趨化因子是指在多種炎症和非炎癥狀態下調節白細胞和其他一些類型細胞進行流動和活化並對這些細胞具有定向趨化作用的細胞因子。目前發現大約50個趨化因子和20個趨化因子受體，根據N末端兩個半胱氨酸的位置，趨化因子被分為4類：CXC, CC, CX3C 和 C。

在腫瘤的缺氧環境中，成纖維細胞分泌的CXCL12(SDF-1)和腫瘤細胞表達的CXCR4都增加，從而刺激腫瘤細胞移動和侵犯。另外，多種趨化因子有促進腫瘤血管生成的作用，如CXCL1,CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6,CXCL7, CXCL8等。CXCR2不僅在腫瘤血管形成中扮演重要角色，而且能向腫瘤微環境中招募巨噬細胞。

腫瘤細胞通過趨化因子來募集內皮細胞、顛覆免疫監視、操縱免疫細胞(免疫編輯)並最終導致免疫逃逸，從而促使腫瘤生長和向遠處轉移。腫瘤細胞不僅分泌趨化因子，也能對趨化因子作出反應。腫瘤轉移的靶器官能分泌的大量趨化因子，由於腫瘤細胞表達一些趨化因子的受體，在趨化因子軸的作用下，引導腫瘤細胞向靶器官轉移（腫瘤轉移的「信號或歸巢」signalingor homing hypothesis）。CCR7/CCL21軸介導腫瘤細胞向前哨淋巴結轉移，CCR7/CCL21軸介導腫瘤細胞向相關淋巴結轉移，而CCR10/CCL27生物軸則參與調節黑色素瘤的皮膚轉移。

6 以腫瘤微環境為靶點的治療策略

理論上直接作用於腫瘤細胞的治療方法有許多不足之處，如腫瘤之間和腫瘤組織內部腫瘤細胞之間的異質性，是造成療效差異的主要原因；腫瘤細胞生物或遺傳特點的不穩定性，在疾病進展和治療過程中，這種不穩定性會不斷增加；目前以腫瘤細胞為目標的治療措施的療效仍有限；在以腫瘤細胞為靶點的治療過程中常有耐葯的 腫瘤細胞克隆出現。

而靶向於腫瘤微環境的治療策略有其自身的的優勢，如腫瘤間質細胞具有穩定的遺傳背景，不易出現突變和耐葯發生；腫瘤微環境的異質性更小，療效相對穩定，並有可能預測腫瘤組織對治療的反應性；在控制腫瘤轉移方面可以發揮極為重要的作用；化療和放療等多種治療措施對間質的作用也是發揮療效的重要側面，有時也可 能是最終的作用路徑。

7 靶向作用於腫瘤微環境的藥物

以腫瘤微環境中的成分作為新靶點的治療方法能克服許多目前傳統治療方式的限制。針對腫瘤基質的靶向治療，由於目標的特異性，將不會有太大的毒副作用。不同於腫瘤細胞，內皮細胞的基因穩定，因此不太可能獲得耐藥性突變。此外，針對腫瘤微環境中多個成分的靶向治療的聯合應用，可以避免單一靶向時腫瘤通過代償彌 補腫瘤生存所需環境物質。此外，聯合方案可降低各自的劑量，從而減少治療相關的毒副作用。此療法的最終目標提高治療效果、延長患者生存。

RGD：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid）；TNF：腫瘤壞死因子；VEGF：血管內皮生長因子；PDGF：血小板衍生的生長因子；ECM：細胞外基質

9

靶向腫瘤幹細胞的治療策略

腫瘤幹細胞(cancerstem cell/tumor-initiating cell, CSC/TIC )是腫瘤細胞中具有幹細胞特性的細胞亞群,其增殖能力明顯強於同一腫瘤組織中的其他癌細胞, 在腫瘤的發生、發展和維持中起十分重要的作用,並且在動物體內表現出很強的成瘤能力。Lapidot等人於1994年報道急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中存在表型為CD34＋CD38－的細胞亞群, 將其注入非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷型(nonobese diabetic/severe combined immune-deficient,NOD/SCID)小鼠體內可誘發白血病。

Muhammad等人在2003年發現乳腺癌中也含有能夠在NOD/SCID小鼠中連續成瘤的幹細胞樣的癌細胞群體,這是首例關於腫瘤幹細胞存在於實體瘤中的報道。至目前為止, 人們相繼在多種原發性腫瘤和癌細胞系中鑒定到腫瘤幹細胞的存在。已發現有腫瘤幹細胞存在的腫瘤種類。腫瘤幹細胞與增殖力較弱的非幹細胞樣腫瘤細胞相比表現出更強的形成腫瘤的能力。O"Brien等人從結腸癌中篩選到含有腫瘤幹細胞的CD133+細胞亞群, 在NOD/SCID小鼠成瘤實驗中顯示出與CD133-細胞亞群在成瘤能力上的明顯差異。1×103個CD133+細胞足以在小鼠體內形成腫瘤, 且成瘤率高達100％, 而CD133-細胞的注射量達到2.5×105時, 僅得到11％的成瘤小鼠。

此外,與腫瘤細胞相比, 腫瘤幹細胞在放化療中表現出更強的抗性, 這與腫瘤幹細胞能更有效的啟動DNA應急反應和高表達耐葯相關蛋白有關。腫瘤幹細胞的高成瘤率和對放化療的抵抗能力,使其在放化療過程中得以存活, 導致腫瘤的複發。因此, 有效的清除腫瘤幹細胞對於獲得理想的抗癌療效十分必要。

各種腫瘤類型中腫瘤幹細胞的分子標記（或分選方法）

（*） 少數樣品腫瘤幹細胞為CD133陰性, （**）待證實

載體直接影響治療作用的發揮, 因此選擇合適的載體對於取得理想的療效很關鍵。目前, 在靶向腫瘤幹細胞的研究中應用最多的載體是小分子抑制劑和融合蛋白。然而,由於靶向性差, 易產生副作用等缺陷, 限制了此類藥劑在臨床治療中的應用。大量研究表明, 病毒尤其是溶瘤腺病毒(oncolyticvirus)比小分子類和蛋白類藥物更適合作為靶向腫瘤幹細胞的載體。

以溶瘤腺病毒為載體的病毒基因治療(gene-virotherapy)方案已在實體瘤治療中取得巨大的成功, 將其應用於靶向腫瘤幹細胞的治療可望獲得更好的療效。此外，腫瘤幹細胞的特性和內部的分子機制與正常幹細胞很相似。根據此特點, 人們制定了一系列具有針對性的治療策略,如抑制增殖, 促進分化, 誘導凋亡,破壞微環境(niche)和增強放化療敏感性等。初步實驗結果表明,這些策略能有效的靶向腫瘤幹細胞並抑制其功能, 達到理想的治療效果。以下將對靶向腫瘤幹細胞治療載體的選擇以及具體靶向策略等問題作一介紹。

1 靶向腫瘤幹細胞的載體

目前應用於腫瘤幹細胞靶向性治療的載體可分為小分子化學物質, 蛋白類製劑和病毒。其中, 溶瘤腺病毒同時具有介導外源基因體內表達和直接裂解腫瘤細胞兩種治療功能,在各種載體中顯現出獨有的優勢。

2 小分子和蛋白類藥物

腫瘤幹細胞靶向性治療的研究當前主要集中於對特效性化學小分子類和蛋白類治療藥物的篩選。其中, 小分子藥物具有易於製備, 適合產業化和無免疫原性等優點, 因而在靶向腫瘤幹細胞尤其是白血病幹細胞的研究中涉及較多。Guzman等人發現蛋白酶體抑制劑MG-132和蒽環類抗生素idarubicin可以選擇性作用於AML幹細胞, 而對正常造血幹細胞沒有影響。

後來, 該研究小組又篩選出一種倍半萜烯內酯Parthenolide藥物, 能夠誘導粒細胞性白血病(myelogenous leukemia)幹細胞發生凋亡。最近有報道證實,小分子抑制劑RHPS4和砷均能夠抑制白血病幹細胞的增殖能力。但是小分子藥物副作用明顯,靶向性差, 多次給葯可引發耐藥性, 這些缺陷大大限制了該類製劑在實際治療中的作用。

將抗體和毒素融合製成的嵌合體－免疫毒素(immunotoxin),可以將起殺傷作用的多肽或蛋白導入表達相應抗原的靶細胞內, 對其實行選擇性攻擊,而不影響其他細胞。已知腫瘤幹細胞存在於有特定表面抗原表型的細胞亞群中, 這為針對性治療的實施提供了有效靶點。部分腫瘤幹細胞的抗原表型。

目前,已有研究小組研製出對腫瘤幹細胞具有靶向性的immunotoxin。例如,Du等人將CD123抗體與假單胞菌外毒素A重組構成immunotoxin, 體外實驗表明該融合蛋白能有效的靶向AML白血病幹細胞。Feuring-Buske等人利用IL-3與白喉毒素的融合蛋白殺滅AML幹細胞, 效果顯著且不會影響正常造血幹細胞。雖然含有特異性抗體的融合蛋白與小分子相比,靶向性得到很大提高, 但免疫原性強和生產成本高仍是其需要克服的缺點。

3 病毒載體

與使用小分子類和蛋白類藥物的治療方案相比, 以病毒為載體的基因療法(gene therapy)則表現出許多明顯的優勢：(ⅰ)能夠介導外源基因高效的進入細胞並長期表達;(ⅱ)某些種類的病毒對腫瘤細胞有天然的靶向性, 經改造後, 靶向性和安全性顯著提高;(ⅲ)不易使機體產生耐藥性。Clement等人使用慢病毒為載體介導的RNA干擾(RNAi), 顯著抑制了膠質瘤細胞的SHH通路活性, 削弱了CD133＋細胞在NOD/SCID小鼠體內的成瘤能力, 有效的靶向了腫瘤幹細胞群體。其中, 慢病毒能維持治療基因長期表達的優勢在實驗中得到體現。

目前, 用於腫瘤基因治療的病毒類載體類型很多。其中, 逆轉錄病毒最早被用於基因治療,其特點是僅整合分裂期細胞。Ho等人在檢測MCM的mRNA表達水平時發現大部分的腫瘤幹細胞處於G0期。而且也另有文獻指出腫瘤幹細胞分裂不活躍。所以, 儘管逆轉錄病毒對腫瘤中分裂旺盛的細胞特異性很強,但並不是靶向腫瘤幹細胞的理想載體。慢病毒克服了逆轉錄病毒對靜止期細胞不能整合的缺點, 還能夠介導外源基因長期表達。但是其產量過低, 即便是第一代慢病毒的產量也不過108-109pfu/mL, 而現在應用最廣的第三代慢病毒的滴度只有106pfu/mL, 不能滿足實際治療對病毒量的需求。

腺相關病毒雖然具有易於操作, 安全性較好,組織特異性靶向等優點, 但其可插入片段的最大長度只有4.7kb,不能同時攜帶多個基因, 所以其在靶向腫瘤幹細胞治療中的應用受到一定限制。痘病毒和單純皰疹病毒也分別由於免疫原性強和可轉染細胞的種類有限而不適合作為靶向腫瘤幹細胞的載體。

改造後的腺病毒是使用非常廣泛的一種腫瘤治療載體, 其相關研究比較深入, 可插入的基因片斷容量大(上限至38kb), 可感染的細胞類型多, 轉染效果好, 包裝滴度非常高(1011-1012pfu/mL), 能夠同時轉染分裂期和非分裂期的細胞, 安全性較好,同其他類型的病毒載體相比, 更適宜成為靶向腫瘤幹細胞的載體。不過,包括腺病毒在內的病毒類載體大都為複製缺陷型, 其複製和感染過程中的關鍵基因已被敲除或突變。經過這種改造的病毒不能在細胞內複製,僅能發揮介導基因在細胞內表達的載體功能, 治療潛能的發揮受到很大限制。

4 新型靶向腫瘤幹細胞載體－溶瘤腺病毒

除了通過介導治療基因的表達來抑制腫瘤的發展外, 病毒還能夠通過自身的複製直接裂解腫瘤細胞。1997年, Heise等人改造了腺病毒的E1B區, 使55kD蛋白缺失, 使之選擇性的在p53異常的腫瘤細胞中增殖,治療效果讓人振奮, 這就是世界上第一個構建成功的溶瘤腺病毒。

實驗室的溶瘤腺病毒載體ZD55也是基於上述原理構建的。該類複製型腺病毒能夠在腫瘤細胞內大量增殖, 最終致使癌細胞裂解而引起瘤體的消退。另外,溶瘤病毒還可以通過誘發機體的免疫反應來增強免疫系統的局部抗腫瘤作用。為了避免溶瘤腺病毒對正常組織產生毒副作用,使其複製能力局限於腫瘤細胞, 人們進行了大量的改造工作, 採用修改病毒自身基因或使用腫瘤特異性啟動子調控病毒複製相關基因表達的策略構建了多種能安全性較高的腫瘤特異性溶瘤腺病毒。

最近, Jiang等人通過實驗發現, 溶瘤腺病毒Delta-24-RGD能夠有效的清除腦癌幹細胞。這是首例以溶瘤腺病毒為治療載體成功殺傷腫瘤幹細胞的報道, 表明了將其應用於靶向腫瘤幹細胞治療的有效性。更重要的是,腫瘤幹細胞中人端粒酶(hTERT)的活性明顯高於正常幹細胞, 而我們自行構建的溶瘤腺病毒載體CHNK300和Ad-TERT使用hTERT啟動子調控病毒複製中起關鍵作用的E1A蛋白, 能夠選擇性的在hTERT轉錄活躍的腫瘤幹細胞中複製而不影響正常幹細胞,在殺傷腫瘤幹細胞的同時又能有效降低毒副作用的產生, 作為靶向腫瘤幹細胞的載體非常理想。

病毒基因治療策略結合了基因療法和病毒療法兩種治療方案的優點, 使用溶瘤腺病毒為治療載體, 介導外源基因進入癌細胞並使之有效表達。該策略不僅可以依靠增殖型病毒的溶瘤作用來直接殺傷癌細胞,還能使攜帶的治療基因拷貝數隨病毒複製而大量擴增, 顯著提升外源基因的治療效果。將構建的攜帶鼠源內皮抑制素(mouseendostatin, mE)的溶瘤腺病毒CHNK300注射到小鼠體內誘發的腫瘤中,28天後, 腫瘤體積消減至770mm3, 而注射了攜載mE的複製缺陷性腺病毒的對照組瘤體僅減小至1400mm3。

大量的證據表明, 以溶瘤腺病毒為載體的病毒基因治療策略表現出良好的應用前景,其治療的效果明顯好於單獨採用溶瘤策略或傳統基因治療策略所達到的療效, 是最有發展前途的腫瘤基因治療方案之一。若使溶瘤腺病毒攜帶針對腫瘤幹細胞的治療基因,應用於靶向腫瘤幹細胞的治療, 可望取得令人滿意的療效。

5 針對腫瘤幹細胞的治療策略

為了限制腫瘤幹細胞在腫瘤發生和維持中的功能, 取得更為理想的治療效果, 研究人員採取了多種行之有效的針對性策略。如抑制增殖,促進分化, 誘導凋亡, 破壞niche和增強放化療敏感性等。

（1）削弱增殖能力

WNT, SHH和Notch等細胞信號通路以及人端粒酶(hTERT)不僅調控幹細胞的自我增殖, 而且在生物體的發育, 成體後組織的恆態維持(homeostasis)中起關鍵作用, 其異常可導致腫瘤的發生。最近的研究表明, 腫瘤幹細胞功能的維持同樣依賴這些通路。因此, 抑制上述信號通路和hTERT的活性將對腫瘤幹細胞自身功能的維持產生很大影響, 從而削弱其增殖能力。

Fan等人用阻礙Notch通路的γ分泌酶抑制劑處理成神經管細胞瘤, 明顯削弱了CD133+腫瘤細胞的增殖力, 但對CD133-的腫瘤細胞分裂沒有影響。Verma等人利用RNAi技術, 下調結腸癌WNT通路中關鍵蛋白β-catenin的表達, 數據顯示, 被處理的細胞在軟瓊脂上形成克隆的比率和在裸鼠體內成瘤的能力明顯下降,表明腫瘤幹細胞的增殖能力被有效抑制。Phatak等人使用小分子藥物RHPS4選擇性抑制白血病幹細胞的端粒酶催化亞基(hTERC), 減弱了其在核內的活性,結果造成白血病幹細胞增殖能力明顯下降。

另外, 胚胎幹細胞增殖和全能性維持所需的Oct3/4、Nanog和Sox2因子等, 對腫瘤幹細胞發揮功能也起到重要作用,提示這些因子也可以作為腫瘤幹細胞的靶點, 用以削弱其增殖能力。

（2）促進分化

腫瘤可以視為異常發育的器官。與正常器官發育的不同之處在於, 腫瘤組織中的幹細胞往往分化異常, 表現為分化過程受阻。因此, 誘導腫瘤幹細胞重新分化, 使其喪失分裂潛能, 同樣可以到達抑制腫瘤的發展的目的。

全反式維甲酸(all-transretinoic, ATRA)最早被用於腫瘤的促分化治療, 在對急性早幼粒細胞性白血病(Acutepromyelocytic leukemia, APL)的治療中表現出良好的療效。Bergmann等人使用組蛋白去乙醯化酶的抑制劑SAHA處理乳腺癌細胞MCF-7, 可觀察到明顯的細胞分化特徵。另外, 化療藥物Cannabinoid也被證實具有誘導膠質瘤幹細胞分化和抑制腫瘤發展的作用。骨形態發生蛋白(Bone morphogen protein,BMP)是一類在多種組織發育中起作用的細胞因子。其中BMP4對神經組織的發育和神經幹細胞的正常有序分化發揮重要功能。最近,Piccirillo等人用外源的BMP蛋白誘導膠質母細胞瘤幹細胞發生分化,結果導致整個腫瘤群體的成瘤能力被嚴重削弱。

（3）破壞微環境

成體組織中的幹細胞均處於niche中。Niche為幹細胞提供養分和保護, 使之免受外來物質的毒害,協助其維持自我增殖能力, 調控其分化進程。因此, 破壞niche會嚴重影響幹細胞的正常功能, 甚至會導致死亡。已有證據證明腫瘤幹細胞也處於niche中以維持其自我更新能力和特性。破壞腫瘤幹細胞所依賴的niche,會嚴重影響腫瘤幹細胞數量和功能的維持。

Calabrese等人證實腦癌的腫瘤幹細胞位於內皮細胞附近的區域,脫離該區域會影響腫瘤幹細胞的增殖能力。此外, 在小鼠腦內成瘤實驗中,與人內皮細胞共注射的腦癌幹細胞的增殖能力明顯強於單獨注射的腦癌幹細胞, 表明破壞腫瘤幹細胞niche會嚴重影響其功能的維持。AML幹細胞為維持其增殖能力必須進入位於骨髓的niche中, 細胞表面的跨膜蛋白CD44, 在其向骨髓遷移的過程中起重要作用。Jin等人用CD44的單克隆抗體H90阻斷CD44與其功能受體的結合, 以阻礙AML幹細胞向niche轉移, 結果大大抑制了其增殖和成瘤的能力。

（4）誘導凋亡

目前, 通過誘導凋亡程序的啟動消滅腫瘤細胞的策略已經被廣泛採納。該策略可以通過兩種途徑實現: 促進促凋亡通路的活性和抑制抗凋亡通路的功能。研究表明,參與這兩種通路的蛋白種類繁多。其中較為常見的促凋亡蛋白包括: p53, TRAIL, caspase3,GranzymeA/B, Bid, Bax和Fas等; 重要的抗凋亡蛋白包括: Bcl-2, Bcl-xL, survivin和XIAP等。通過載體介導外源促凋亡蛋白的表達, 或使用RNAi技術抑制抗調亡蛋白的翻譯, 是目前常用的誘導細胞凋亡的手段。

Zhang等人使用溶瘤腺病毒ONYX-411攜帶能沉默突變型K-ras的siRNA轉染特定癌細胞,能有效促進腫瘤細胞凋亡的發生。如果更進一步, 不是僅僅通過單個途徑,而是在表達促凋亡蛋白的同時抑制抗凋亡通路的活性, 則能更有效的誘導癌細胞凋亡。Pei等人使用溶瘤腺病毒ZD55介導Smac和TRAIL在肝癌細胞內同時表達, 在抑制抗凋亡蛋白表達的同時促進凋亡通路的活性, 與單獨使用Smac或TRAIL相比,能更好的殺死腫瘤細胞。

Lebedeva等人將白介素-24(IL-24)和一段能沉默突變型K-ras基因的反義RNA(K-ras AS)同時插入複製缺陷型腺病毒中構建成攜帶雙基因的載體, 經實驗證明比只攜帶IL-24或K-ras AS的腺病毒有更強的誘導胰腺癌細胞凋亡的能力。我們可以採用同樣的策略,選用對腫瘤幹細胞有靶向性的病毒載體, 同時攜帶雙基因, 誘導腫瘤幹細胞進入凋亡程序, 直接清除該細胞群體。

（5）增加對放療和化療的敏感性

放療和化療是當前腫瘤治療的常規手段。但是在連續多次治療後, 腫瘤容易產生抗藥性, 致使療效欠佳。另外, 放化療後腫瘤的複發也是臨床治療中的常見問題。一般而言, 放療主要影響的是分裂期細胞而對非分裂期細胞作用不明顯。然而,腫瘤幹細胞分裂緩慢, 多處於非分裂期, 因此對放療的反應不敏感。放療結束後, 腫瘤幹細胞重新增殖直接導致腫瘤的複發。

Bao等人經研究 發現, 膠質瘤幹細胞與非幹細胞樣膠質瘤細胞相比, 能更有效的啟動DNA損傷檢驗點反應, 減少射線對其造成的傷害。在實驗中,他們又通過抑制檢驗點激酶Chk1和Chk2的活性, 成功的削弱了膠質瘤幹細胞對射線產生傷害的抵抗能力, 恢復了其對射線的敏感性。

另一方面, 腫瘤幹細胞對化學藥物的多葯抗藥性(multidrug resistance, MDR)與BCRP1、MGMT, 抗凋亡蛋白和MDR相關蛋白的高表達有密切關係。通過抑制這些抗性相關蛋白的表達,可以增強腫瘤幹細胞對藥物的敏感性, 提高其在化療中的死亡率。可見,通過消除腫瘤幹細胞對射線和藥物的抗性這一策略, 仍然能夠依靠放化療這些傳統的治療手段來有效的清除腫瘤幹細胞。

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靶向腫瘤代謝的策略

1、腫瘤無氧糖酵解途徑的異常和調節，PKM2為關鍵分子

腫瘤細胞的能量供應主要依賴於無氧糖酵解，而丙酮酸激酶（PK）是這一過程中的限速酶，有兩個異構體，分別為PK-M1和PK-M2，其中前者較後者有更高的活性。然而，既往研究顯示，腫瘤細胞中活性較低的PK-M2呈高表達，而非活性較高的PK-M1。

美國學者孔（Kung）等通過採用PK-M2的異構激活劑AGX-257作用於多種腫瘤細胞，發現PK-M2的活性提高後腫瘤生長受到抑制；而通過對AGX-257作用前後進行對比發現，活性低的PK-M2無法將糖酵解途徑中的中間體全部轉化為丙酮酸，導致這些中間體合成絲氨酸進入氨基酸代謝途徑，從而促進了腫瘤的生長。PK-M2激活劑可以作為腫瘤聯合治療的一部分。本研究不僅解釋了腫瘤選擇性高表達活性低PK的原因，更為重要的是，還為腫瘤的靶向治療提供了新的治療策略。

2、線粒體功能異常的調控作用。

線粒體是正常細胞的主要供能單位，而腫瘤細胞即使在有氧的條件下也以無氧糖酵解為主要的獲能方式（即Warburg效應）。另外，腫瘤細胞中的線粒體數量並沒有明顯減少，提示腫瘤細胞的線粒體功能是異常的。國立衛生研究院（NIH）在內的一個聯合研究團隊，通過建立不同背景的線粒體和細胞核融合模型，發現功能異常的線粒體具有促進細胞生長和克隆形成的能力，而正常細胞的線粒體則不具備這一功能。

來自美國霍華德-休斯醫學研究所的肖（Shaw）等發現，腫瘤細胞內的功能異常線粒體存在自嗜障礙，其主要的調節因子是ULK1（一種絲/蘇氨酸蛋白激酶），ULK1上調可促進線粒體的自嗜，而ULK1的上游調節因子是LKB1。有趣的是，在非小細胞肺癌中，LKB1的突變率高達30%，且常與KRAS突變並存。研究者通過建立LKB1缺陷動物模型進行藥物篩選，發現一種線粒體複合體Ⅰ的抑制劑phenformin對LKB1缺陷及突變型腫瘤細胞具有殺傷作用。此外，該研究團隊還進一步構建了LKB1和KRAS雙突變模型，發現phenformin同樣有效，且可以逆轉RAS-MEK抑制劑的耐葯。清除腫瘤細胞的線粒體可能成為靶向治療的新手段，其中靶向突變型的LKB1可能成為肺癌新的治療手段。

3、中間體及其代謝物的調節作用

腫瘤細胞長期處於應激的微環境中，在代謝過程中會產生一系列活性氧簇（ROS），包括O2-、H2O2、HO2、OH等。ROS具有雙向調控腫瘤細胞凋亡和增殖的作用，中、高濃度的ROS可以誘導細胞凋亡和死亡，而低濃度ROS能夠影響一系列信號傳導途徑，促進細胞增殖和分化，但其中的機制尚不明確。美國芝加哥大學海（Hay）等發現，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是調整ROS濃度的關鍵點。提示檢測並調整NADPH的濃度，有可能成為新的抗腫瘤治療手段。

腫瘤代謝途徑異常主要是由於兩方面原因。第一，表達代謝途徑中限速酶的基因突變或擴增，如膠質瘤和急性白血病中IDH1和IDH2基因出現突變，遺傳性副神經節瘤中SDH基因功能缺失性突變，腎癌中FH基因功能缺失突變導致HIF-1α的穩定，以及黑色素瘤和乳腺癌中PHGDH的擴增和過表達。第二，控制代謝途徑的癌基因和抑癌基因出現變異，例如PI3K/AKT/mTOR和AMPK的活化可以增加葡萄糖攝取、脂質合成及抑制自嗜，p53活化可誘導自嗜並增強線粒體的代謝功能，myc擴增或過表達可增加腫瘤細胞對谷氨酸的利用等。

因此，阻斷代謝途徑中的關鍵限速酶或者干預其上游的癌基因或抑癌基因均可在一定程度上抑制腫瘤的發展。目前在臨床應用中，單一信號通路的靶向治療效果常不理想，旁路途徑的激活是重要原因之一。而克服旁路激活導致的耐葯，目前多採用橫向聯合多條信號通路抑制劑的方式。由於各條信號通路最終會通過調控下游的代謝來影響細胞行為，因此縱向聯合信號通路和代謝途徑抑制劑亦可能產生增強的抗腫瘤效果。然而，代謝途徑中存在不同的代謝通路，不同類型或不同狀態的腫瘤細胞可能依賴於不同的代謝通路，因此發現腫瘤特異的代謝通路及其中的關鍵限速酶就成為腫瘤代謝學的重點和難點。

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針對端粒末端轉移酶的靶向治療

端粒末端轉移酶和端粒在細胞衰老或永生化過程中起決定性的作用。端粒末端轉移酶活性的再活化與腫瘤的生長有關，是惡性腫瘤共有的一個特徵。因此，一些臨床前及臨床研究證據認為端粒末端轉移酶有望成為腫瘤治療的新靶點。最近，Marian 等用端粒末端轉移酶抑制劑 GRN163L 靶向惡性膠質瘤（glioblastoma， GBM）幹細胞，體外及體內實驗均顯示出良好的治療效果。

GRN163L 能夠使 GBM 幹細胞端粒縮短、降低增殖率，導致幹細胞死亡。GRN163L 與替莫唑胺及放射治療聯合應用能夠發揮協同作用，更有效地抑制 GBM 幹細胞的生長。發揮協同作用的機制：一方面，在端粒末端轉移酶缺失的情況下，射線和替莫唑胺導致的 DNA 斷裂不能被修復；另一方面，替莫唑胺能夠啟動惡性膠質瘤細胞的自溶作用，而 GRN163L 能夠使該作用進一步加強。此外，GRN163L 能夠通過血-腦脊液屏障，克服了常規抗腫瘤藥物的不足。

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miRNAs與腫瘤靶向治療

miRNAs是真核生物細胞中固有的一類長度約為22個核苷酸且不編碼蛋白的小分子RNA。miR2NA在轉錄後水平負性調控靶基因的表達,通過與mRNA3』端非編碼序列的結合或降解mRNA或抑制mRNA轉錄後的翻譯。miRNAs廣泛參與動植物生命活動的調控,如生長發育、營養物質的代謝和激素的分泌等。近年的研究表明,其不僅在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用,在幹細胞的自我更新和多向分化方面也起著重要作用。用生物信息學的方法發現,一些調控幹細胞自我更新的因子,如Notch和PTEN,是miRNAs的靶基因,雖然這些結果尚待實驗的證實,而且miRNAs調控幹細胞自我更新的機制也需進一步深入的研究。

Hatfield等發現,在Dicer21(miRNAs生成過程中所必需的一種核糖核酸酶)突變的果蠅GSC細胞中,大部分細胞都停滯在細胞周期G1到S的轉變期中,說明幹細胞通過G1/S期轉變需要miRNAs的作用,miRNAs在幹細胞自身穩態的維持中發揮著重要的作用。僅在腫瘤幹細胞中就有大量的miRNA表達，如下表；

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其它靶點

目前，針對上述多條通路中一些關鍵分子的抑制劑研究都有不同程度的進展。如O6-苄基鳥嘌呤( O6-BG)及其多個衍生物能特異抑制DR通路中O6－烷基鳥嘌啉－DNA 烷基轉移酶（AGT），目前正在作為耐葯逆轉劑與甲基化劑合用進行臨床試驗。還有靶向抑制BER通路中的多聚(ADP-核糖)聚合酶（poly[ADP- ribose]polymerase，PARP）的AG014699、NU1025、AG14361和INO-1001分別處於Ⅰ～Ⅲ期臨床實驗。

這些抑制劑與烷化劑、拓撲異構酶I抑制劑、順鉑或γ－射線聯合用於腫瘤細胞或者小鼠移植瘤，能分別增加後者引起的DNA損傷、細胞生長抑制和荷瘤小鼠的存活時 間。現今，關注最多的是修復DSBs的HR和NHEJ通路，分別在這兩條通路中扮演關鍵角色的ATM和DNA-PK都是PI3K激酶家族成員，前文已經提到的wortmannin、LY294002和咖啡因等PI3K家族的廣譜抑制劑都能通過抑制這兩條修復通路的活性起到放化療增敏的作用。

另外，還有 ATP的競爭抑制劑KU-55933能顯著抑制ATM活性，且作用明顯強於對PI3K家族其它成員的抑制效果，能增強ATM高表達細胞株對離子輻射和 VP16、阿黴素、喜樹鹼等造成DSBs藥物的敏感性。DNA-PK的選擇性抑制劑IC87361、Nu7026、Vanillin和SU117582也 有相似的作用。

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結語

多個分子靶向藥物的成功上市為新一代抗腫瘤藥物的研發提供了樂觀的前景。但是，必需看到靶向信號通路抑制劑只有在該信號通路高度激活的腫瘤上才產生更好地療效，因此合理的臨床設計是體現其療效的必要前提。只有在合理的研究策略、全面的臨床前評價和嚴謹合理的臨床試驗的共同配合下才能開發出更多有希望的靶點特異性抗腫瘤新葯。

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