倚天不出，誰與爭鋒？細數細胞增殖檢測5大門派

作者：李彥艷 哈爾濱市二院檢驗科

前言：細胞動力學是研究細胞群體內各部分細胞運動規律的學科。腫瘤的細胞增殖研究早期工作由於受方法學的制約主要限於實驗腫瘤 ,隨著分子生物學的飛躍發展和免疫組織化學技術的改進 ,多種與細胞增殖有關的生物標誌物得以發現並逐漸有了深入地認識 ,檢測方法不斷更新。

細胞增殖檢測主要分為幾個門派：

DNA合成檢測 代謝活性檢測 細胞增殖相關抗原檢測

ATP濃度檢測 流式細胞術檢測細胞增殖

1

DNA合成檢測

DNA合成檢測是目前實驗室中檢測細胞增殖最準確可靠的方式。

（1）：獨家秘方：將放射性標記的3H-胸腺嘧啶與細胞一同孵育幾小時或者孵育過夜。這樣新增殖細胞的DNA中就會摻入放射性標記，經洗脫後可用閃爍計數器SC檢測。

軟肋:該方法時間耗時長，使用和處理放射性物質既麻煩又不安全。

（2）用5-溴-2-脫氧尿苷BrdU來進行類似實驗，因為BrdU也同樣可以摻入到新合成的DNA中。胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養加入，而後利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。

很可愛：不需要放射性物質。BrdU標記很適合免疫組化IHC、免疫細胞化學IC、細胞內ELISA、流式細胞分析和高通量篩選。

討人厭：需要進行額外的實驗步驟，先孵育特異性BrdU單抗和帶標記的二抗，然後再進行比色法、化學發光檢測或熒光信號檢測等步驟。

圖一 DNA分裂周期圖片

（3）EdU（5-Ethynyl-2』- deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在複製的DNA分子中，通過基於EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA複製活性，適用於細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒複製、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。

優點：與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準確。EdU染料只有BrdU抗體的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等），可有效避免樣品損傷，而且無需抗原抗體反應，能在細胞和組織水平更準確地反映DNA複製活性。

圖二 EdU及BrdU原理示意圖

2

代謝活性檢測

2、代謝活性檢測

檢測細胞群體的代謝活性也可以反映細胞增殖的情況。在細胞增殖過程中乳酸脫氫酶的活性會增加，因此四唑鹽或者Alamar Blue在代謝活躍的細胞環境中會逐漸減少，形成能夠改變培養基顏色的甲臢染料。通過低配置或高配置的分光光度計和酶標儀來讀取含染料培養基的吸光度，從而衡量細胞的代謝活性，檢測細胞增殖的情況。

四種最常見的四唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1。

MTT缺點：在標準的細胞培養基中是不溶的，而且其生成的甲臢晶體需要溶解在DMSO或者異丙醇中。因此，MTT主要作為終點檢測方法。

更準確地反映DNA複製活性。

MTT試劑盒圖片

其他三種鹽與Alamar Blue一樣，都是可溶且無毒的。它們可以作為連續監控手段來跟蹤細胞增殖的動態改變。

XTT缺點：效率較低，需要添加額外的因子。而WST1更靈敏有效，與其他鹽相比能夠更快顯色。Alamar Blue的靈敏度也很高，只要微孔板的孔中有100個細胞它就能夠檢測到。四唑鹽和Alamar Blue氧化還原染料能夠用於多種儀器和

高通量研究，非常方便。它們適用的檢測儀器包括：標準分光光度計、熒光分光光度計和酶標儀等。

CCK-8的原理跟MTT其實是相同的，不同之處在於CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培養液加入有機溶劑溶解這個步驟，因此可以減少一定的誤差。

優點：重複性優於MTT；對細胞毒性小；為1瓶溶液，毋需預製，即開即用。缺點： CCK-8比MTT的價格要貴不少。

3

增殖標誌檢測

有些抗原只存在於增殖細胞中，而非增殖細胞缺乏這些抗原，可以通過特異性的單抗來對細胞增殖進行檢測。例如，在人體細胞中，Ki-67抗體識別同名蛋白，在細胞周期S期、G2期和M期表達，而在G0期和G1 期（非增殖期）不表達。用針對Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細胞的增值情況。由於需要組織切片，這種方法無法進行高通量分析。不過這一方法頗受癌症研究者們的青睞，因為它能夠用來檢測體內腫瘤細胞的增殖。其他普遍使用的細胞增殖或細胞周期調控標誌還包括，增殖細胞核抗原PCNA、拓撲異構酶IIB和磷酸化組蛋白H3。

4

ATP檢測

細胞內的ATP含量受到了嚴格調控，檢測ATP也可以得到細胞增殖的信息。死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數之間存在嚴格的線性關係。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發光為基礎。如果有ATP存在熒光素酶就會發光，而且其發光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發光信號的光度計和酶標儀都可以方便的進行檢測。這種方法非常適用於高通量細胞增殖檢測和篩選。

5

流式細胞術檢測細胞增殖

CFSE (5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀醯亞胺酯),會隨著細胞分裂平均地分配到個子代細胞中從而通過其熒光的減弱反映標記細胞的增殖。

後記：細胞增殖是生物體的重要生命特徵，細胞以分裂的方式進行增殖，是生活細胞的重要生理功能之一。細胞的增殖是生物體生長、發育、繁殖以及遺傳的基礎。我們在做實驗時，應該熟悉每種方法的利弊，選擇合適的試劑盒，使其更好地為臨床服務。

參考文獻：

劉迂，何澤生，吳金生《細胞增殖檢測及臨床意義》

胡義平 , 劉叔文 `李曉娟,南方醫科大學藥學院 , 510515廣州醫學.院附屬腫瘤醫院藥學部，廣州510095《CCK-8法與FACS對CD3+抗體誘導小鼠Treg 細胞免疫抑制作用的比較 》`《現代免疫學 》 2013年第33卷第 1期

圖片來源於網路

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！