新疆地區維吾爾族單純性先天性心臟病患者GATA4基因突變分析

張為民，李 劍，阿布都沙拉木·吐爾遜，葉爾買克·唐沙爾汗，

買買提艾力·艾則孜，阿依別克·乃比，常冬慶，張總剛

（新疆維吾爾自治區人民醫院心外科，烏魯木齊830001）

摘要：目的 探討新疆維吾爾族單純性先天性心臟病( congenital heart disease，CHD)與GATA4基因突變的關係。方法 對1 65例維吾爾族單純性CHD患者(CHD組)和1 65例維吾爾族體檢健康者（對照組）血液樣本進行DNA提取、目的基因PCR反應及測序，與GeneBank和英國人類基因突變資料庫(HGMD)進行比較以識別基凶突變，並對氨基酸序列進行分析。結果 CHD組3例檢出致病GATA4基因突變，具體為c.1138 G>A(p．Val380Met)，c.1180 C>A(p.Pr039/IThr)，c.1220 C>A(p.Pr0407Gln)，其中1例房間隔缺損患者攜帶p.Pr0394Thr突變為1個新突變，1例窒間隔缺損患者同時攜帶p.Val380Met和p.Pr0407Gln突變，臨床罕見；對照組均未發現GATA4基因突變。結論 新疆維吾爾族單純性CHD患者GATA4基因突變率較低，GATA4基因突變可能是部分CHD患者的病因。

關鍵詞：先天性心臟病；基凶突變；GATA4基凶；維吾爾族

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是指胎兒期心臟血管發育異常而導致的心血管畸形，在嬰幼兒出生缺陷中居首位，也是新生兒非感染性疾病死亡的首要因素，發病率約8‰～12‰，且呈逐年遞增趨勢。CHD發病機制目前尚未闡明，主要由環境因素、遺傳因素或二者共同作用引起。目前已證實多個基因突變或表達失調與CHD發病相關。

GATA4基因是與心臟發育密切相關的轉錄因子之一，基因突變後其蛋白的轉錄活性下降，通過調控a-MHC，cTnC，ANF，Myl3等心臟發育相關因子來影響心臟發育，並引發CHD。CHD具有顯著的遺傳異質性，不同人群致病基因／突變並不相同。本研究探討新疆地區維吾爾族單純性CHD患者GATA4基因突變情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1月 201 6年1月新疆自治區人民醫院診治單純性CHD患者1 65例（CHD組），男76例，女89例；年齡3個月～61歲，中位年齡29歲；均為維吾爾族，無血緣關係；單純性CHD經超聲心動圖和外科手術確診，其中房間隔缺損( atrialseptal defect，ASD) 120例，室間隔缺損(ventricularseptal defect，VSD) 40例，動脈導管未閉(patentductus ateriosus，PDA)3例，肺動脈狹窄(pulmonarystenosis，PS)2例。排除標準：有其他先天畸形者；染色體異常或綜合征型心血管異常者。同期1 65例維吾爾族體檢健康者為對照組，男78例，女87例；年齡4個月～60歲，中位年齡29歲。2組年齡、性別比例差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審批通過，研究對象或監護人均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 血液標本採集和基因組DNA提取 2組均採集外周血5mL，EDTA抗凝，應用基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit，天根生化科技北京有限公司）提取全血基因組DNA，-20℃存放備用。

1.2.2 PCR反應 採用Primer 5．O軟體設計引物，使擴增產物完全覆蓋GATA4基因的不同區域。共設計6對引物，由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成(表1)。PCR反應體系為20 ruL，其中基因組DNA 2ruL，PCR體系（Goldstar Best MasterMix，北京康為世紀生物科技有限公司）10_uL，水6_uL，GATA4上、下游引物各1 ruL。擴增條件：預變性95℃10 min，變性95℃30 s，退火64℃30 s，延伸72℃90 s，循環35次，延伸72℃10 min。PCR產物用體積分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認。

1.2.3DNA測序及突變分析 PCR擴增產物均採用DNA膠回收試劑盒（天根生化科技北京有限公司）進行純化，應用AB13 730XI。全自動DNA測序儀進行序列測定。將測序結果與美國國立生物技術信息中心( National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GenBank資料庫、英國人類基因突變資料庫( HGMD)中GATA4基因標準序列(NM_002052)進行比對，明確核苷酸變異的位點和類型。在國內外資料庫如PubMed資料庫，中國知網CNKI資料庫和萬方資料庫檢索有關GATA4基因的文獻，確認突變是否已有報道。

2 結 果

2.1 GATA4基因突變篩查結果 對照組均未發現GATA4基因突變。CHD組3例發生GATA4基因突變：1例ASD患者發生c．1138G>A雜合錯義突變，即其編碼核苷酸序列第1138位的鳥嘌呤( guanine，G)變為腺嘌呤(adenine，A)，引起380位氨基酸密碼子由GTG變為ATG（圖1），使相應氨基酸發生改變(p．Val380Met)而造成錯義突變；1例ASD患者發生c.1180 C>A雜合錯義突變，即其編碼核苷酸序列第1180位的胞嘧啶( cytosine，C)變為A，引起394位氨基酸密碼子由CCC變為ACC（圖2）．使相應氨基酸發生改變(p. Pr0394Thr)而造成錯義突變；1例VSD患者發生c．1138 G>A和c．1220 C>A 2個雜合錯義突變，其中c．1220 C>A突變致使第1220位的C變為A，引起407位氨基酸密碼子由CCA變為CAA（圖3），使相應氨基酸發生改變(p．Pr0407Gln)而造成錯義突變，導致蛋白結構發生相應改變。

2.2 3個GATA4基因突變在進化上的保守性分析與人(NP_002043.2)、大鼠(NP_032448. 2)、小鼠（NP一653331.1）、狗（XP一543205.2）、黑猩猩（XP_508070.2）和雞（XP_420041.1）多物種GATA4基因編碼氨基酸序列比對結果顯示，GATA4基因編碼的第407位的脯氨酸在進化上高度保守，而第380位的纈氨酸和第394位的脯氨酸並不高度保守。

3討 論

心臟發育是個極其複雜的動態過程，涉及多個轉錄因子在胚胎髮育過程中不同時間、不同空間的先後表達和相互作用。任何1個基因結構或量的異常均可導致心臟發育異常。心臟特異轉錄因子的突變是CHD遺傳學方面的主要病因。GATA4基因是近年來發現的心臟前體細胞最早期的轉錄因子之一，在心臟發育過程中發揮重要作用。人類GATA4基因位於染色體8p23.1，全長55 757 bp，有7個外顯子，其中第1外顯子不參與編碼，其餘6個外顯子編碼442個氨基酸。GATA4基因包含一個高度保守的DNA結合區域，這個區域由2個鋅指結構( Cys-X2-Cys-X17Cys-X2-Cys)組成，在進化過程中高度保守。GATA4基因通過其鋅指結構與其他心臟特異性的轉錄因子相互作用，是心臟發生調控網路中非常重要的轉錄因子。GATA4基因首先在心前區的中胚層表達，隨後在心內膜和心肌中表達，主要參與心臟的正常發育及心原細胞在心臟的特異分化和遷移。GATA4基因正常表達對心臟的環化，心房、心室發育，房室瓣形成以及傳導系統的維持起著關鍵作用。

動物胚胎模型研究結果顯示，GATA4基因表達失活可導致各種心臟畸形，包括ASD、VSD、房室間隔缺損、右心室發育不良、心內膜墊缺損、法洛四聯症、右心室雙出口和心肌肥厚等。目前研究結果認為，GATA4基因病理性突變可引起基因產物的轉錄活性下降，影響其他心臟發育相關因子發揮作用，從而影響心臟正常發育，最終導致CHD發生。

Garg等對2個獨立的單純性CHD家系進行分子遺傳學研究，首次證實了GATA4基因突變是CHD致病因素之一。近年來對CHD患者進行GATA4基因突變篩查的報道漸多，發現GATA4基因突變極具異質性，突變涵蓋ASD、VSD、心內膜墊缺損、動脈導管未閉、肺動脈狹窄、法洛四聯症、有心室雙出口、右心室發育不良和左心發育不全綜合征等類型。國內外流行病學研究結果發現，CHD存在家族聚集現象，在CHD家系中ASD是最常見的一種攜帶GATA4基因突變的臨床表型。

本研究對維吾爾族1 65例單純性CHD患者和1 65例體檢健康者GATA4基因外顯子編碼序列進行檢測，發現對照組均未發現GATA4基因突變，3例CHD患者GATA4基因中識別jLI_1 3個雜合錯義突變p. Val380Met, p.Pr0394Thr和p.Pr0 407Gln。p．Val380Met和p．Pr0407Gln突變已有報道，但1例VSD患者同時攜帶p．Val380Met和p．Pr0407Gln突變，為首次報道。1例ASD患者攜帶p．Pr0394Thr錯義突變，經文獻檢索查詢發現此突變位點尚未見報道，該突變致使極性中性氨基酸的蘇氨酸代替了非極性氨基酸的脯氨酸，使氨基酸的性質發生變化，可能導致患者發病。

本課題組前期對62例維吾爾族CHD患者進行GATA4基因突變篩查，檢測到2種GATA4基因錯義突變p．Pr040-Gln和p．Asp425Asn，其中p．Pr0407Gln在1例法洛四聯症患者中檢出，而p．Asp425Asn存在於1例VSD患者。多物種GATA4基因編碼氨基酸序列比較分析結果表明，p．Pr0407Gln突變位點均位於GATA4基因高度保守區域。該區氨基酸的改變可能會影響GATA4基因轉錄活性。用PMut軟體和SIFT軟體對p．Pr0407Gln突變預測，發現該突變為病理性突變，並可能影響蛋白質功能，該突變可能與CHD發病相關。

通過檢索PubMed資料庫和HGMD資料庫等，目前為止共發現超過130個GATA4基因突變位點，GATA4表現出高突變性和潛在致病性，但仍缺乏基因型臨床表型相關性的研究，每種突變所對應的臨床表型尚未確定。本研究擴大了CHD相關GATA4基因的突變譜，加深了對GATA4基因突變與CHD臨床表型間關係的認識。

GATA4基因是心臟發育的重要轉錄因子，新疆維吾爾族單純性CHD患者GATA4基因突變率較低，GATA4基因突變可能是部分特發性CHD患者的病因。多數學者認為，CHD是一類多基因遺傳病，是由環境因素和遺傳因素相互作用引起的，遺傳因素在其發病中起著主導作用，僅從單純基因突變不能完全解釋基因與CHD的關係。對CHD相關的遺傳環境共同作用機制進行深入研究，有助於揭示CHD新的分子病因。

來源：選自醫學空間戰略合作夥伴《中華實用診斷與治療》雜誌，2017，31（5）：431-434，轉載請標明出處！

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