mRNA中m5C的測序及其功能

根據中心法則，DNA儲存的遺傳信息經RNA傳遞到蛋白，其中RNA發揮重要的承上啟下的作用。而RNA自身又受到多個層面的調控，其中化學修飾能夠改變RNA的功能和穩定性。目前發現的100多種化學修飾中，有2/3為甲基化修飾，其中m6A的研究最為透徹，本系列已有多篇文章介紹，這裡就不再贅述。另外一種重要的修飾形式——5-甲基胞嘧啶（m5C）,在RNA中廣泛分布，早在上世紀70年代就已發現存在於mRNA上，但由於技術的局限性，一直沒有得到充分研究。隨著近些年技術的發展，m5C的研究開始得到越來越多的關注。然而m5C在mRNA上的分布規律並不明確，其對mRNA的轉錄後調控功能尚不了解。

為了分析mRNA上m5C的分布規律，我們首先對HeLa細胞的mRNA上的m5C修飾進行了研究。利用優化的RNA m5C單鹼基測序分析方法（圖1），我們發現mRNA上m5C修飾水平的中位數為20.5%，主要分布於CDS和CG富集區域（圖2）。進一步分析發現，m5C在mRNA翻譯起始位點附近有顯著的富集，且主要位於其下游100 nt附近（圖2）。

圖1 、m5C測序建庫方法

圖2、 mRNA m5C修飾分布特徵

接下來，我們對mRNA m5C修飾是否具有組織特異性進行了研究。利用發現UHPLC-MRM-MS/MS技術，我們發現小鼠的六個組織（小腸、心臟、肌肉、大腦、腎臟和肝臟）中mRNA含有的m5C修飾水平是變化的，其中心臟和肌肉組織的修飾水平最高（圖3）。進一步高通量測序分析發現，和HeLa中修飾的特徵類似，組織中m5C修飾水平的中位數為20.6%-23.2%（圖3），同樣主要分布於CG富集區和編碼區（圖3），且富集於mRNA翻譯起始位點附近（圖3）。這些結果說明mRNA上m5C的水平及分布具有一定的保守性。

圖3、小鼠組織mRNA m5C位點修飾水平及分布規律

接著，對含有m5C的mRNA進行功能聚類分析發現，這些mRNA既有參與共同的生物通路，如翻譯，又有參與組織特異的功能通路（圖4）。進一步對特異的位點分析，我們發現，特異位點所在的mRNA與組織特異的功能密切相關（圖4）。

圖4、小鼠不同組織mRNA m5C特異性

為了研究發育過程中，mRNA上m5C是否動態變化，我們對不同鼠齡的小鼠睾丸進行研究。結果發現m5C修飾在睾丸發育過程中是高度動態變化的，且與不同階段特異功能相關（圖5）。

圖5、小鼠睾丸發育過程mRNA m5C位點特異性

為了研究m5C的甲基轉移酶，我們根據已有報道，對NSUN家族蛋白進行研究。結果發現只有NSUN2能夠顯著影響mRNA上的m5C修飾水平，且其催化活性依賴於C271和C321，說明NSUN2是mRNA上m5C的甲基轉移酶（圖6）。

圖6、3.3 NSUN2催化mRNA上m5C的生成

為了研究m5C的生物學功能，其結合蛋白的發現至關重要，我們利用oligo-pull down結合蛋白質譜發現oligo- m5C 結合的ALYREF顯著多於oligo-C（圖7）。

圖7、oligo-pull down聯合質譜鑒定m5C結合蛋白

接下來，我們利用pull-down和凝膠遷移實驗（EMSA）對這一結論進行驗證，結果均顯示oligo- m5C結合ALYREF的能力顯著強於oligo-C（圖8）。

圖8、m5C結合蛋白ALYREF的驗證

進一步利用RIP技術，我們發現ALYREF結合的mRNA上的m5C修飾水平升高約8.7倍，且同樣顯著傾向存在於翻譯起始位點附近（圖9）。

圖9、ALYREF結合RNA上m5C的特徵分析

通過對ALYREF的蛋白序列與DNA上5mC的結合蛋白MBD家族和RNA m6A結合蛋白YTH家族進行比對分析，選取9個相對保守的氨基酸位點進行定點突變。利用EMSA和PAR-CLIP技術，我們發現K171的突變能夠顯著降低ALYREF結合m5C的能力，進而降低其與RNA的結合能力（圖10）。

圖10、K171是ALYREF結合m5C的關鍵位點

ALYREF是出核複合體TREX的組成蛋白，它在介導mRNA出核的過程中扮演重要的調控作用。根據上述ALYREF能夠特異性地結合m5C的結果，我們猜想ALYREF是否通過結合mRNA m5C，進而介導mRNA出核？為了驗證這一猜想，我們首先分別對NSUN2和ALYREF進行敲低，利用免疫熒光原位雜交（FISH）技術觀察mRNA出核的變化。結果發現，敲低NSUN2和ALYREF後，核內mRNA的信號顯著增加，而胞質中則顯著減少（圖11），說明mRNA出核效率隨著NSUN2和ALYREF的敲低而降低。

圖11、NSUN2和ALYREF的敲低抑制mRNA出核

接著，我們分別在NSUN2和ALYREF敲低的HeLa細胞中過表達NSUN2和ALYREF的野生型和關鍵位點突變體。免疫熒光原位雜交（FISH）結果顯示，只有NSUN2和ALYREF的野生型能夠分別回補NSUN2和ALYREF敲低而導致的mRNA出核降低（圖12）。

圖12、NSUN2和ALYREF野生型與突變型回補mRNA出核實驗

接下來我們在單基因水平上對其進行檢測。我們根據高通量測序的分析結果，分別挑選出三類基因：1、含有m5C修飾且受NSUN2調控的基因；2、含有m5C修飾但不受NSUN2調控的基因；3、不含有m5C修飾的基因。發現在NSUN2敲低情況下，只有第一類基因出核效率顯著降低，而在ALYREF敲低的情況下，第一類和第二類基因出核效率均顯著降低，第三類基因不受兩者影響（圖13）。

圖13、單基因出核驗證

為了進一步驗證m5C調節mRNA出核的功能，我們構建了minigene的出核報告系統。發現NSUN2和ALYREF敲低後，FBXW9-EGFP mRNA在細胞質中的定位顯著降低，反之在細胞核中的定位顯著增加（圖14）。對m5C位點突變後發現，m5C的喪失不影響FBXW9-EGFP mRNA的轉錄生成，但顯著降低了出核效率。

圖14、mini-gene 報告系統的出核驗證

總而言之，本研究首先建立改進的RNA m5C單鹼基解析度高通量測序與生物信息分析技術，揭示了mRNA m5C的分布規律，並繪製了精細的m5C修飾圖譜；發現mRNA m5C的分布特徵在哺乳動物中十分保守，而在不同組織中修飾的基因具有特異性, 並且在小鼠睾丸發育過程中， m5C具有動態性；發現了mRNA m5C主要甲基轉移酶NSUN2（Writer）及其第一個結合蛋白ALYREF（Reader），並揭示了m5C調控mRNA出核的重要功能。

圖15、工作模型

圖16、期刊封面圖

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