到底誰才是最強蛋白組定量分析方案？

導讀

對於在發現階段廣泛應用的非靶向蛋白組定量分析，近年來比較熱門的應該是以iTRAQ和TMT為代表的標記技術。此外，原來被寄予厚望的非標記（Label free）蛋白定量，由於重現性不佳等缺點，已經快被大家所遺忘——直到，我們近期推出了Label free升級版（詳見系列報道看懂這4個W，帶你走進Label free的世界）。憑藉數據非依賴型採集模式（Data-independent acquisition, DIA）的優勢，蛋白定量Label free分析終於又可以自由自在地開展了！

可是，面對科研工作者的各種實驗設計，到底在iTRAQ和Label free升級版兩種非靶向蛋白組分析策略中，該如果選擇呢？科技君今天就再開一文，幫大家好好判斷一下。

Label free升級版vsiTRAQ

1、iTRAQ的肽段標記 V.S. Lable free的無標記——iTRAQ容易引入實驗誤差，也會受到標籤種類限制。

iTRAQ由於實驗需要，會在蛋白樣本酶解成肽段後，給不同樣本的肽段標記上等重同位素標籤（圖1）；Label free不對樣本進行標記（圖2）。標記步驟使得iTRAQ技術在第一步引入實驗誤差，而且標籤種類（8個）限制了iTRAQ一批次比較的樣品個數。

圖1 iTRAQ流程示意圖

蛋白提取-酶解-標記-混合上機-標籤碎裂-通過二級譜圖報告集團峰強度定量

圖2 label free流程示意圖

蛋白提取-酶解-樣本分別上機-通過比較樣本的峰面積定量

2、iTRAQ樣本混合上機 V.S. Label free升級版樣本分別上機——10個樣本以內的定量比較，Label free升級版再准，也難超iTRAQ。

iTRAQ標記後樣本混合上機，避免分批次上機引入的實驗誤差，理論上可實現100%平行比較；label free升級版樣本分別上機，即便是使用高穩定性質譜儀和iRT矯正工具，理論上也無法實現100%的平行比較。（參考圖1、2）

3、iTRAQ液相色譜（LC）分組分 V.S. Label free升級版不分組——iTRAQ分組分鑒定率高，Label free升級版不分組鑒定難度大，需增加譜圖庫的建庫成本。

iTRAQ在LC-MS/MS前進行一向液相色譜分多個（一般為20個）組分，充分降低樣本複雜程度，鑒定效果好；Label free升級版為了壓縮單個樣本上機時間，一般不進行一向液相色譜分組，樣本複雜程度相對較高，鑒定難度大。

為了獲得更好的鑒定效果，Label free升級版在樣本上機前需要構建一個分組的混合樣品庫，輔助進行樣本的蛋白鑒定，完美解決樣本鑒定難度大的問題，但會增加成本。

4、iTRAQ DDA V.S. Label free升級版 DIA——DIA模式完勝，但DIA數據處理難度大。

iTRAQ採用數據非依賴性採集（Data-dependent acquisition, DDA），數據會有不全面性和隨機性；Label free升級版採用DIA模式，數據相對完整，重複性好，但數據處理難度大。（圖3）

圖3 DDA vs DIA

DDA挑選一級譜中強度最強的20-30個離子進行二級質譜，母子離子對具備一一對應關係；

而DIA選擇一定荷質比範圍內全部的離子進行二級質譜碎裂，母子離子不具備一一對應關係。

DIA數據採集，依賴於質譜儀的掃描速度和解析度，需配備高性能質譜儀（如Q Exective HF）；DIA模式的數據採集，會產生大量的數據，給分析帶來很大困難，專業分析軟體（如Spectronaut）才能處理這些數據。

通過DIA模式採集到的數據，可重複利用其進行分析，不會受限於時空差異；而DDA模式的數據，受限制比較大，一般不同時間不同地點採集到的數據，無法同時進行比較。

5、iTRAQ信號強度定量 V.S. Label free升級版二級質譜峰面積定量——Label free定量更準確。

iTRAQ根據二級質譜的標籤斷裂後的碎片信號強度進行定量，定量標準一致，但也存在降低二級肽段碎片信號的可能，影響鑒定效果；label free升級版根據肽段碎片的質譜峰面積進行定量（圖4），定量依據更豐富，定量更準確。

圖4 DIA定量方式

DIA通過比較兩個樣本分別上機採集到的二級譜圖的峰面積定量

綜上，科技君給大家總結一下，以下情況可優先選擇iTRAQ：

1、實驗組數低於8組（即同時比較的樣本數≤8）

2、樣本背景極為相似（相同物種和相同的樣本類型）

3、經費有限，需要通過高性價比方案完成研究

更適合選擇Label free升級版的情況：

1、實驗組數高於10組

2、不同物種、不同來源或部位的樣本，需要同時進行蛋白組分析和定量

3、需要區分樣本中的「有無蛋白」

4、追求更精準的定性定量效果，避免標記和液相分組引入的實驗誤差

5、需要對採集的數據進行多次分析

（介於9-10個樣本的項目，科技君推薦華大IBT 10-plex定量產品，可詳詢。）

這麼看來，如果您要進行蛋白組分析，樣本量＞10，想不受限制地獲得更為豐富和精準的數據，華大的Label free升級版一定是您的「不二之選」！

近期，華大參與了一項關於蛋白質組分析重複性、定性定量準確性的實驗室間評估項目。該項目召集了分散在全球的11家實驗室，共同對HEK293細胞系進行蛋白質組檢測，發現採用DIA採集模式的數據，在各個實驗室間能獲得一致的敏感度、動態範圍和重複性。研究證實，通過DIA數據採集模式進行大範圍的蛋白定量（Label free升級版）得到的數據重複性等方面值得信賴，華大在DIA模式下的蛋白定量分析技術也得到了全球範圍內的認可，該項目結論文章已被國際期刊Nature Communication接收。

最後，各位看官，請把您的研究內容發給我們，讓我們來幫您選擇一個更好的實驗方案吧~

撰稿：段 欣

編輯：市場部

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