如何攻克人基因組重測序的「疑難雜症」

人基因組研究一直是醫學研究的重中之重，由於人基因組的複雜性，高GC，高重複區域一直是人基因組研究的「疑難雜症」。今天小編就帶大家來了解一個專治這些疑難雜症的利器——基於PacBio Sequel平台的三代測序。

三代測序

為何能解決這些疑難問題

1. 讀長超長，平均12K，可輕鬆跨越高複雜區域，從而精確解析染色體結構變異及融合基因等；

2. 無GC偏好性，DNA無需PCR擴增，保證了基因組覆蓋的完整性和均一性；

3. 可直接獲得甲基化等表觀遺傳信息。

三代測序

人基因組研究中的四大應用

1. 單基因病，複雜疾病

2. 癌症研究

3. 單體型分型

4. 表觀遺傳研究

案例解析

單基因病，複雜疾病

Long-read whole genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease[1]

期刊：BioRxiv

研究背景

Carney綜合征（Carneycomplex, CNC）是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，位於17號染色體的抑癌基因PRKAR1A與CNC發病有關，因此又稱為CNC1基因，該基因的突變可引起腫瘤發生。本文的研究個體為18歲便已患過四次腫瘤的Carney綜合征疑似患者。但臨床PRKAR1A基因突變檢測顯示為陰性。第二次使用Illumina HiSeq 2500平台進行了全基因組測序分子診斷，平均測序深度36×，但此次分析同樣沒有檢測出任何可以解釋患者臨床表徵的遺傳變異。斯坦福大學等單位利用PacBio技術進行了第三次測序。

技術路線

數據發現

1. 26.7Gb數據，測序讀長N50為9612bp。

2. 檢測出大於50bp的6971個缺失和6821個插入變異。

3. 通過陰性對照對比，共鑒定出重要的3個插入和3個缺失變異，其中就包含PRKAR1A。在PRKAR1A基因第一個外顯子中包含2184bp的雜合性缺失突變。Sanger測序結果也發現此缺失突變的存在。

圖1 雜合性變異位點的鑒定

研究結論

人類基因組中存在著許多低複雜度的區域，如重複序列和高多態性的區域、HLA區域等，這些區域的存在對短讀長和基於參考的基因組組裝是非常大的挑戰。雖然目前的SRS已經在單核苷酸和小插入/缺失變異的遺傳發現中非常成功，但最近的研究表明我們大大低估了基因組中結構變異的複雜性，另外，許多疾病正是由超出SRS解析度範圍的序列重複引起的。

癌症研究

RecurrentDUX4fusions in B cell acutelymphoblastic leukemia of adolescents and young adults[2]

期刊：Nature GeneticsIF：31.616

研究背景

急性淋巴白血病（ALL）是一種常見癌症，與基因的融合密切相關。RNA-seq雖然能鑒定出融合基因，但受限於短讀長，無法檢測出完整的融合基因序列，也無法準確鑒定出插入序列的拷貝數。日本東京大學等單位通過SMRT測序對ALL融合基因進行了研究。

技術路線

數據發現

1. 轉錄組二代測序分析發現：DUX4融合基因僅存在AYA-ALL人群中；

2. 發現D4Z4重複片段插入IGH基因中，但是無法檢測完整的融合基因序列，也無法鑒定插入IGH基因的DUX4拷貝數；

3. SMRT測序準確檢測到單拷貝的D4Z4片段在IGHM與IGHJ4位點間插入；雙拷貝D4Z4片段在IGHJ6與IGHV3-15位點間插入；同時還檢測到IGHD2-15和IGHVII-60-1區域發生了輕微重排；

4. 小鼠疾病模型驗證發現：野生型DUX4會抑制細胞分化，而高表達DUX4-IGH基因會促使B細胞前體轉化成白血病。

圖2 SMRT鑒定DUX4-IGH融合基因微重排

研究結論

基因融合在基因組中非常普遍，也是一些類型癌症的標誌。SMRT藉助超長讀長在檢測發現融合基因的基礎上，能夠精確檢測融合基因的插入位點以及插入片段拷貝數。

三代

測序

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！