「基因魔剪」致數百個非目標突變？學者：還無法排除其他可能

近日，一篇發表於《自然-方法》期刊的通訊文章讓不少人再次審視「基因魔剪」CRISPR的安全性。在不到千字的正文中，來自美國哥倫比亞大學等機構的研究人員稱，經CRISPR基因編輯的小鼠會出現數百個意想不到的非目標突變，認為可能是CRISPR的脫靶現象引起。

但有科學家對這篇通訊文章結論的可信度打上了問號。

「由於論文提供的實驗證據有限，目前還不能得出CRISPR/Cas9具有更大安全隱患的結論。」中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧對澎湃新聞（www.thepaper.cn）表示。

中國科學院上海神經科學研究所研究員楊輝及其博士研究生唐騁持相同觀點，在6月2日發表於微信公眾號《知識分子》的撰文中，他們表示：「文章本身的實驗和數據也只是展現一種可能性，但並不足以支撐起一個科學結論所需的完整邏輯結構。」

中國科學院動物研究所幹細胞與生殖生物學國家重點實驗室研究員李偉也對澎湃新聞表示：「這篇文章的方法和結果並不令人信服，仍需同行驗證。」

經過鋅指蛋白和TALEN兩代基因編輯技術之後，借用自然界規律的後起之秀CRISPR因為技術門檻低、效率高，成為目前全球實驗室最為常用的基因編輯技術。CRISPR的中文全稱是「成簇的規律間隔的短迴文重複序列」，化用的是細菌免疫系統應對噬菌體的特殊機制，在嚮導RNA的帶路下，Cas9蛋白可對目標DNA片段進行切割。

通訊文章寫了什麼？

在5月30日在線發表於《自然-方法》的通訊文章中，研究人員表示，通過CRISPR基因編輯技術，他們將兩隻盲鼠的致盲基因進行修復。

修復後，通過全基因組測序，他們發現，與未經過CRISPR編輯的小鼠相比，兩隻經過改造的小鼠發生了100多個基因片段的插入或缺失（indel）、上千個單核苷酸突變（SNV）。其中，有117個基因片段缺失或插入和1397個單核苷酸突變是兩隻盲鼠共有的。研究人員認為，這可能是因為CRISPR編輯目標緻盲基因時出現了脫靶現象。

基因編輯的脫靶問題並不是一個新事物，就算第三代基因編輯技術、有「基因魔剪」之稱的CRISPR也沒有完全避免。所謂脫靶，指的是基因編輯工具工作時，可能「傷及無辜」，除了人們想改變的目標基因外，無意中改變了其他基因。

自從CRISPR系統問世以來，科學家們不斷在提高CRISPR系統的特異性，減少脫靶現象。目前，通過計算機模擬程序，實驗室里的科學家可以預測基因組中可能的脫靶位點，並重點檢查模擬結果中最可能脫靶的幾個區域。

但研究人員發現，他們實驗中發現的這些改變是計算機模擬軟體所無法預測到的，從而建議業內今後使用全基因組測序的方法來檢測體內編輯後是否有脫靶導致的突變。

同行為什麼認為結論可信度不高？

首先是研究的樣本量。「樣本量太少，無法區分『突變』的來源，是這個研究的最主要問題。」李偉說。作為一篇簡短的通訊文章，研究人員所用來得出結論的數據僅來自兩隻實驗鼠和一隻對照鼠。

楊輝覺得這樣的樣本量是「嚴重不足的」，「因為你無法分清這個結果究竟只是這一兩隻動物的『個案』，還是某種普遍的規律，而只有大量的重複才能抹平一隻只小鼠的『個性』，從中總結出最普適的結論。」

在劉光慧看來，缺乏合適的實驗對照也使得該研究可能流於「個性」。該研究僅僅使用了1隻非注射組小鼠作為對照，嚴格的實驗設計應該包含更多的對照以排除不同小鼠之間固有的遺傳差異。他表示，即便在同一組織內，細胞和細胞之間在基因序列上也可能存在著一定的差異（即異質性）；這些個體、組織、細胞之間的差異需要謹慎地排除，不能簡單將其歸因為基因編輯所致的突變。

楊輝和劉光慧在實驗對照組的設計改進上提出了類似的看法：為了嚴謹性和科學性，一方面，該研究應該同時包含基因編輯小鼠的父母系作為測序的對照，這樣可以部分確認突變是來自遺傳還是因為基因編輯。另一方面，由於CRISPR的工作機制是在嚮導RNA的帶領下找到目標基因，再用Cas9「剪刀」進行切割。該研究應該補充分別單獨注入嚮導RNA和Cas9的對照實驗，從而判斷是否突變真的是由於CRISPR切割所造成的脫靶效應。

此外，值得注意的是，基因尤其是單核苷酸的突變在自然界無時無刻不發生著，這意味著研究人員需要排除突變是不是天工所為。「突變本來又會在DNA複製和細胞分裂的過程中自然發生，因此他觀察到的突變有多少是由CRISPR引發的脫靶，是否廣泛存在，仍然需要其他同行的驗證。」李偉說。

利用全基因組測序的方法來評估基因編輯工具的脫靶效應，這是該通訊文章的創新之處，但劉光慧有他的擔憂。

「在技術層面上，目前的全基因組測序會不可避免地報告少數『假陽性』的突變結果，這些結果需要後續用生物信息學和Sanger測序等手段進一步『過濾』和確證，才能最終得到確鑿的結論。」劉光慧向澎湃新聞解釋，理論上CRISPR/Cas9產生的大多數突變更有可能是插入缺失突變（indel），而該研究顯示單核苷酸變異（SNV）似乎比插入缺失突變（indel）還要多，這些不尋常的現象需要格外加以關注。

總而言之，研究人員通過全基因組測序發現了以數百計的突變，然而，要將這些直觀的「突變」與CRISPR的脫靶效應關聯起來，建立確鑿的因果關係，需要層層地排除其他可能性，方可定論。但目前，根據該通訊文章所呈現的實驗設計、數據，諸多可能性尚無法排除。這也是劉光慧、李偉、楊輝為這篇通訊文章打上的最大問號。

科學家怎麼看基因編輯的安全性爭議？

對於基因編輯這一革命性的生物技術，安全性總是敏感地橫亘在大眾心頭。此次《自然-方法》的通訊文章掀起波瀾，讓CRISPR技術相關的上市生物公司股價受到波動。

「在更多證據出來之前，我們既不能輕率地說CRISPR/Cas9有嚴重缺陷或是《自然-方法》登錯了文章。」儘管對該通訊論文所得結論暫時保留意見，楊輝和唐騁表示：「CRISPR/Cas9作為一種對人類未來命運休戚相關的重要生物技術，一些謹慎的聲音總是很有意義的。」

李偉相信基因編輯技術具有重要臨床應用前景，談及基因編輯的安全性問題，他說：「任何生物技術，包括基因編輯技術在內，在臨床的應用都需要經過嚴格的安全性和有效性評估，過度的樂觀和輕易的悲觀都是不利於其發展的，需要足夠的耐心和毅力來制定嚴格的安全性和有效性評估標準並完成它。」

「基因編輯技術的安全性一直是臨床試驗不能迴避的問題，在將基因編輯應用於臨床試驗之前，必須確定其安全性和有效性。」劉光慧說：「從積極的方面看，該論文再一次敲響了警鐘，提醒人們要嚴格評估任何一種臨床治療方案的安全性。其實，這對於從事基因編輯研究的科研人員來說更多的是一種激勵。」

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