高通量測序DNA樣本建庫方法（3）：擴增法

擴增法建庫，是指利用PCR方法擴增特定的分子片段，並在擴增過程中引入接頭和測序引物區域的建庫方法。

其目前在微生物領域應用最廣，主要應用在宏基因組測序，用於檢測微生物群體的組成結構。主要包括16S rDNA測序、18S rDNA測序、ITS測序及目標區域擴增子測序等。採用第二代高通量測序平台測定的16S/18S /ITS某個高變區域的序列，來反應環境樣品在細菌、真菌、古菌分類方面物種之間的差異，對研究海洋、土壤、腸道糞便等環境中的微生物構成有重要的指導作用。

擴增子建庫目前市場上一般不收費！不收費！不收費！（重要的事情說三遍）。

和機器打斷法、轉座酶法動輒每個樣幾百塊錢的建庫費用比起來，可以節省一大筆開銷。

為啥不收費呢？

原理上說，擴增子建庫的過程其實就是PCR過程，實驗成本主要是酶和引物，相對成本較低。

其操作過程目前主要有2種流程選擇（一步法建庫和兩步法建庫）。

一步法建庫是指通過一輪PCR反應，同時進行16S擴增和接頭連接的工作，如下圖a所示。

兩步法建庫是指通過兩輪PCR反應，分別進行16S擴增以及接頭連接的工作，如下圖b所示。

原理上很簡單，成本很便宜。

那麼，是否擴增子建庫就可以替代其他兩種建庫方法了呢？非也！

1、擴增子測序只能檢測樣本中某一或幾個特定基因片段，而並非所有的基因。建庫過程中經過了PCR富集和篩選，將研究者所感興趣的片段幾萬幾十萬倍的放大。好處是，研究有針對性，有的放矢；缺點是，信息不全面，例如，只能檢測樣本中某種菌的有無，卻不可能檢測其耐藥性或毒力。

2、擴增子建庫過程中，受酶、擴增循環數等諸多因素的影響。最終檢測的微生物群體組成和樣本中真實狀態會有一定的偏差。基本上，樣本起始濃度越高，建庫循環數越大，實驗中採用的酶越便宜，實驗結果與真實情況偏差越遠。（關於這方面，感興趣可以翻筆者之前的貼子「【好文共賞】一管窺豹，SOP標準化在宏基因組研究中的重要性」）

微微碎碎念: 擴增子測序適合進行宏基因組測序，例如糞便、痰液、土壤等。其成本較低，易於開展，值得注意的是，其結果極易受實驗操作的影響，容易產生假陽性結果，因此，建議實驗過程一定要注意標準化！

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