SHANK2基因表達下調對誘導多能幹細胞來源神經發育模型早期發育的影響

龔思亦, 陳曉霞, 康賽, 師玲玲

暨南大學 粵港澳中樞神經再生研究院, 廣東 廣州 510630

通信作者：師玲玲,副研究員,研究方向:自閉症家系分析及易感基因致病機制探索,E-mail:tlingshi@jnu.edu.cn

[作者簡介] 龔思亦(1989-),女,研究方向:SHANKs等自閉症易感基因致病機制探索,E-mail:siyi1201@126.com

基金資助:國家自然科學基金項目(31400922)

【摘要】目的:探索 SHANK2基因表達下調對誘導性多能幹細胞神經發育模型的早期影響.方法:體外建立人誘導多能幹細胞來源的神經發育模型,構建攜帶靶向敲減 SHANK2基因表達信息shRNA的慢病毒,在發育起點感染細胞模型.在發育第3、6、9、12、15天分別固定細胞,熒光顯微鏡拍照,動態監測繼發於 SHANK2表達下調的胞體面積、突起長度與分支、生長錐面積等神經元形態發育變化.結果:體外成功建立人誘導多能幹細胞來源的神經發育模型.與shControl組相比,在發育不同時間點shSHANK2組神經元分支個數減少、突起長度減小,shSHANK2組神經元胞體面積、生長錐面積均有所減小.結論: SHANK2基因敲減導致早期神經元形態發育異常,可能是 SHANK2導致自閉症譜系障礙的潛在致病機制之一.

【關鍵詞】SHANK2; 誘導性多能幹細胞; 自閉症譜系障礙; 神經發育

[中圖分類號]Q189

[文獻標誌碼]A

DOI: 10.11778/j.jdxb.2017.03.002

自閉症譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)是一種以社交和溝通技能缺失以及刻板行為和重複性行為為特徵的廣泛性神經發育障礙[1, 2].目前認為ASD的發病與遺傳密切相關[3].SHANKs蛋白家族是突觸後緻密區的支架蛋白, 其中SHANK2(SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2)是SHANKs蛋白家族的一個亞型[4].相關研究通過對ASD病人進行基因組測序和外顯子測序發現ASD病人的SHANK2外顯子區域有不同程度的突變和拷貝數變異[5, 6], 提示SHANK2是ASD的候選基因[7, 8, 9, 10, 11].不同研究通過構建SHANK2外顯子基因敲除小鼠模型, 發現SHANK2基因敲除會影響神經元形態與功能的發育, 並導致社交障礙等自閉症行為[12, 13].但動物模型不能完全模擬人類遺傳背景, 特別是與神經發育相關的神經精神疾病, 成體動物細胞無法反應完整神經發育過程.

本研究採用人誘導性多能幹細胞來源神經發育模型, 探討SHANK2基因敲減對神經元早期發育的影響, 為研究SHANK2基因遺傳變異導致神經發育異常的機制提供實驗依據.

1 材料和方法

1.1 材料

iPSC細胞系購買於廣州中科院, 從人類尿液脫落上皮細胞重編程誘導而來.iPSC細胞在一定條件下能誘導成神經幹細胞, 進而分化為神經元.iPSC培養基與mTeSRTM1培養基購自美國Stemcell Technologies公司; 基質膠購自美國BD公司; DMEM/F-12、Neurobasal、N-2補充因子、B-27補充因子、Glutamax、NEAA、2-Mercaptoethanol、EGF、bFGF與Accutase購自美國Life Technologies公司; SB431542與Drosomophorim 購自美國Tocris Bioscience公司; Dibutyryl cyclic-AMP購自美國Sigma-Aldrich公司; Recombinant Human BDNF購自美國PeproTech公司.

1.2 方法

(1)iPSC細胞的培養和神經誘導

iPSC細胞培養在用基質膠包被過的6孔板中, 貼壁生長.培養液為mTeSRTM1.每日換液, 當細胞密度達到95%左右用EDTA進行消化傳代至6孔板.

將iPSC細胞1∶ 1傳代培養在用基質膠包被過的12孔板中, 當細胞密度達到100%時, 換N2B27+雙抑制劑培養液(含體積分數分別為48.1% DMEM/F-12、49% Neurobasal、0.5% Glutamax、0.5%NEAA、0.2%Insulin、0.5%N-2、1%B-27、0.1%Heparin、0.1%2-Mercaptoethnol, 另外加入濃度均為5 μ mol/L SB431542與Drosomophorim), 隔天換液.

D8(誘導培養第8天), 用機械力將12孔板中的細胞刮至用基質膠包被過的6孔板中(1∶ 1), 換N2B27(含體積分數分別為48.1% DMEM/F-12、49% Neurobasal、0.5% Glutamax、0.5% NEAA、0.2% Insulin、0.5% N-2、1% B-27、0.1% Heparin、0.1% 2-Mercaptoethnol), 隔天換液.

D16(誘導培養第16天), 用機械力將6孔板中的細胞刮至T25瓶, 懸浮培養.培養液為N2B27+EGF+bFGF(含體積分數分別為48.5% DMEM/F-12、49% Neurobasal、0.5% N-2、1% B-27、另外加入質量濃度分別為20 μ g/L EGF、20 μ g/LbFGF), 隔天換液.待神經小球長到足夠大, 用Accutase酶進行消化傳代.

(2)轉染神經小球

神經小球傳到第3代, 分別感染帶有RFP信號的對照組(shControl)和SHANK2基因敲減組(shSHANK2)病毒後, Accutase酶進行消化後, 吹成單細胞懸液, 種於鋪有玻片、基質膠包被過的24孔板中(1.0× 105個細胞/孔), 培養液為N2B27+CAMP+BDNF(含體積分數分別為48.5% DMEM/F-12、49% Neurobasal、0.5% N-2、1% B-27、另外加入濃度為1 μ mol/L CAMP、質量濃度為20 μ g/L BDNF).收集神經元發育過程不同時間點的樣品, 用於神經元形態學的分析.

(3)細胞的固定、拍照與分析

分別取D3(誘導培養第3天)、D6(誘導培養第6天)、D9(誘導培養第9天)、D12(誘導培養第12天)、D15(誘導培養第15天)不同時間點的shControl組和shSHANK2組樣本, 用體積分數為4% PFA固定30 min後封片.用蔡司熒光顯微鏡的RFP通道拍攝不同時間點的細胞圖像.用Image J軟體 1.4.3.67 (NeuronJ 1.4.3)分析神經元胞體、樹突、軸突、生長錐的發育情況.

(4)細胞免疫組化

取iPSC細胞、發育過程中NPC細胞及發育第15天成體神經元細胞, 體積分數為1%PBS洗兩遍後, 體積分數為4%PFA常溫固定20 min 24孔板500 μ L/孔.PBS洗3遍, 孵上一抗稀釋液, 24孔板200 μ L/孔, 冷庫4℃過夜12~16 h.PBS洗3遍, 加二抗稀釋液, 24孔板200 μ L/孔, 常溫避光孵育1.0~1.5 h.PBS洗兩遍, 取24孔板中的玻片加到有2.5 μ L封片劑的載玻片上.用蔡司熒光顯微鏡不同通道拍攝細胞圖像.

(5)慢病毒包裝

慢病毒載體包裝委託吉凱基因公司完成.

1.3 數據統計

用GraphPad Prism5.01專業繪圖軟體進行統計學分析.

2 結果

2.1 體外神經發育模型的構建

實驗成功將iPSC細胞誘導成神經前體細胞(neural precursor cells, NPC), 進一步分化為神經元.本實驗用到的人iPSC細胞用免疫組織化學的方法可以陽性標記iPSC細胞特異性多能幹性標誌蛋白OCT4和SSEA4, 證明了iPSC細胞的乾性(圖1A), 具有多項分化潛能; 通過免疫組織化學方法檢測神經前體細胞的特異性乾性標誌蛋白NESTIN和SOX2, 結果均為陽性, 證明發育模型中神經前體細胞形成(圖1B); 培養21 d, 用免疫組織化學方法檢測神經元特異性標誌蛋白Tuj-1, 星形膠質細胞特異性標誌蛋白GFAP.結果表明, 本實驗成功構建iPSC來源的神經發育模型.

2.2 構建靶向下調SHANK2基因慢病毒載體

該慢病毒具有RFP紅色熒光信號(圖2A)同時攜帶靶向於SHANK2基因的shRNA.經q-PCR技術檢測發現該慢病毒敲減效率在50%左右(圖2B).

2.3 SHANK2敲減對神經元胞體面積的影響

分析shControl組和shSHANK2組在D3、D6、D9、D12、D15時間點神經元胞體面積的變化.結果表明, 與對照組相比, SHANK2敲減後在D3、D9、D12、D15神經元胞體的面積均有所下降(圖3,P< 0.05).其中D9, 與對照組相比SHANK2敲減後胞體的面積明顯下降, 並具有顯著性差異(P< 0.000 1).

2.4 SHANK2敲減對神經元突起分支個數和長度的影響

分析shControl組和shSHANK2組在D3、D6、D9、D12、D15時間點神經元突起的分支長度和數量的變化.將神經元樹突一級分支、二級分支作為單獨參數統計發現, SHANK2基因表達下調導致神經元樹突一級、二級分支個數在發育D9和D15顯著減小(圖4C、D, P< 0.01), 如果綜合考慮神經元樹突一級、二級、三級分支個數分結果顯示SHANK2基因表達下調導致神經元樹突總分支個數在發育D3、D6、D9、D15顯著減小(圖4B, P< 0.05).

分析SHANK2表達下調對總突起長度發育的影響, 結果顯示SHANK2基因表達下調導致神經元突起總長度在發育D6、D9、D12、D15顯著減小(圖4E)(P< 0.05).如果將突起長度分為樹突和軸突來評估, 研究顯示SHANK2基因表達下調導致神經元軸突長度在發育D9、D15顯著減小(圖4F, P< 0.05), 神經元樹突長度在發育D6、D9、D12、D15顯著減小(圖4G, P< 0.01), 說明SHANK2基因表達下調主要通過影響樹突長度來影響神經元突起長度生長.

2.5 SHANK2敲減對神經元生長錐面積的影響

根據生長錐的形態將生長錐分為3種類型:鈍平狀、絲狀、片狀.其中鈍平狀生長錐為收縮狀態; 片狀生長錐面積大, 為展開狀態; 中間狀態為絲狀生長錐.結果表明:SHANK2基因表達下調在發育動態時間點均導致神經元生長錐面積顯著減小(圖5B)(P< 0.05).其中片狀生長錐面積在發育D3、D9、D15顯著減小(P< 0.01), 絲狀生長錐面積在發育D6、D9、D15顯著減小(P< 0.05), 頓平狀生長錐面積在發育D6、D9、D12、D15顯著減小(P< 0.05).

3 討論

自閉症譜系障礙疾病是以社交交往障礙,刻板性、局限性和重複性行為等廣泛發育障礙為特徵的神經發育障礙疾病[14].ASD疾病發生髮展與多種因素相關, 目前已明確遺傳因素是兒童自閉症的重要病因[15].SHANK2等基因定位於突觸後, 行使突觸後骨架蛋白的穩定作用, 分子流行病學研究提示:SHANK2基因是ASD疾病顯著相關的易感基因[5, 6].但分子流行病學研究是基於ASD患者的遺傳背景, 進行SHANK2等候選基因的分子流行病學調查, 通過「 逆推」 預估候選基因作為易感因素的可能性, 尚需建立細胞/動物模型「 順行」 驗證SHANK2遺傳變異繼發的病理生理學致病機制.不同研究顯示動物來源的細胞敲減/敲除模型和基因敲除實驗動物模型, SHANK2等易感基因變異可導致神經元形態、功能異常, 但是SHANK2不同外顯子敲除動物模型呈現不一致的自閉症樣行為[12, 13].這些差異可能是由於實驗動物遺傳背景不能完全不等同於人類遺傳背景而產生.基於ASD疾病的遺傳背景複雜多樣性、人與動物的種屬差異性及人類ASD遺傳信息尚難以全面拷貝至其他物種的局限性, 基因敲減/敲除動物模型和動物來源的細胞模型難以全面、準確複製人類複雜多樣的遺傳變異信息, 可導致SHANK2等ASD易感基因的臨床致病機制不能客觀、全面地闡述, 也造成動物模型研究的結果難以直接指導臨床診療.如果能在體外構建人源性神經發育模型, 建立ASD候選基因研究載體, 將使研究結果更貼近臨床轉化.

胚胎幹細胞的出現使人源性神經發育模型成為可能, 但其應用存在倫理局限性.誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通過成體細胞重編程技術建立的多潛能幹細胞.2007年, 日本科學家Yamanaka等[16]利用Sox2, C-myc, Klf4與Oct3/4 4種轉錄因子將人成纖維細胞重編程為多能幹細胞, 從而成為幹細胞研究中的重大突破.誘導性多能幹細胞可來自成體細胞, 成體細胞來源廣泛, 取材簡單; 使用患者自身的誘導性多能幹細胞可避免機體的免疫排斥反應.目前, 利用誘導性多能幹細胞作為自閉症等神經疾病的實驗室研究模型已經成為研究熱點[17].若採用人源誘導多能幹細胞來源神經發育模型模擬ASD候選基因表達異常, 探索候選基因的致病機制, 不僅完整反應了人類遺傳背景, 也克服了成體細胞無法重現神經發育過程的局限性.

本研究建立了人成體細胞重編程iPSC來源的神經細胞發育模型, 所建立的神經發育模型可以發育為具有成熟神經元標記的神經細胞; 同時本研究通過慢病毒載體構建實驗性SHANK2遺傳變異, 結果提示, SHANK2基因敲減導致神經元形態發育異常:神經元突起長度與分支個數在不同發育時間點顯著較小; 胞體面積、生長錐面積在發育不同時間點顯著減小.神經元突起的正常發育是突觸結構發生的基本前提, 後者是建立神經元之間理化聯繫及神經元之間電活動產生的結構基礎; 生長錐是影響神經元生長導向的重要亞結構基礎, 在神經發育初期及神經損傷修復過程中面積顯著增大[18], 以感知突起延伸局部微環境, 繼而決定神經元生長導向; 同時SHANK2是突觸後緻密區域的骨架蛋白, 各種離子通道受體和肌動蛋白通過直接或者間接方式錨定在SHANK2骨架蛋白上, SHANK2在維持神經元正常細胞形態、生理結構方面起重要作用[19].本研究中, 繼發於SHANK2遺傳變異的神經元突起、胞體、生長錐發育異常可能引起神經元功能發育異常, 繼而導致ASD等神經發育疾病的產生.

本研究首次採用人源神經發育模型探索SHANK2遺傳變異引起神經元形態、功能發育, 從而導致患者自閉症相關表型發生的相關致病機制, 所採用的mRNA表達干擾體系以慢病毒為載體, 從神經發育起點開始至整個發育過程都持續保持SHANK2基因敲減水平, 是穩定的基因功能研究模型; 並綜合分析繼發於SHANK2表達異常的神經元樹突、軸突、胞體和生長錐面積等參數動態發育異常, 精確模擬遺傳相關神經發育疾病的候選基因致病機制, 為進一步探索ASD相關候選基因致病機制提供了實驗依據.

參與文獻略

通信作者：師玲玲，2013年暨南大學綠色通道引進的副研究員。

? 師玲玲，暨南大學醫學博士，美國南加州大學Zilkha神經遺傳研究所博士後。2013年迄今在所在依託單位暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院建立了人類誘導多能幹細胞來源的神經發育模型，基於此模型，建立了神經發育疾病相關候選基因的研究平台，本研究是在國家自然科學基金等數項基金資助下採用人尿液來源成體細胞重編程為誘導多能幹細胞，繼而誘導分化為成體神經元，採用免疫熒光和顯微成像技術，詳實描述了神經發育疾病相關候選基因的潛在致病機制。

來源：選自醫學空間戰略合作夥伴《暨南大學學報》，轉載請標明出處！

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