基因編輯，別忘了還有ZFN和TALEN

本文轉載自「生物通」。

基因編輯對生物醫學研究的影響不亞於30年前的PCR。近年來，鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應子（TALEN）和規律成簇的間隔短迴文重複（CRISPR）已經掀起了一浪又一浪的基因編輯高潮。

從時間上看，ZFN是最早的，接著是TALEN，最後是CRISPR。每一次成功的交替，都伴隨著操作更簡便、應用更普及。CRISPR的出現，大大簡化了基因編輯的操作，因此被研究人員廣泛採用。

儘管如此，ZFN和TALEN仍被人們認為在基因治療中前途光明，因為它們比CRISPR更加精確。Schaefer等人近期在《Nature Methods》上發表文章，通過深度測序揭開CRISPR的脫靶效應。作者指出：「我們發現了大量意想不到的單核苷酸變異，而不是像人們普遍認為的那樣，CRISPR主要在與sgRNA同源的區域產生插入缺失。」

「CRISPR的簡便讓基因組編輯迅速普及，改變了疾病研究的面貌，」MilliporeSigma的基因編輯負責人Martha S. Rook博士談道。「然而，對於那些需要知識產權專利的關鍵研究，成熟的基因編輯技術（如ZFN和TALEN）仍然是首選方法。」

重回ZFN？

CRISPR是依賴基因靶向的嚮導RNA來結合特定的序列，而ZFN則不同，它是由蛋白構成的。這些結構域蛋白經過優化，可提高精確度和特異性，適合臨床基因編輯。

據Sangamo的副總裁Michael Holmes博士介紹，ZFN需要的蛋白改造知識比CRISPR要多。「這也就是為什麼研究人員在考慮基因編輯時，第一時間想到CRISPR，但對於治療而言，最簡單的也許並不是最好的。」

2015年12月，美國FDA批准了Sangamo的B型血友病治療方案（SB-FIX）。這種方案是在患者肝臟細胞的白蛋白基因位點中插入治療基因。「當我們將治療基因插入這個非常強大的啟動子時，我們能夠將肝臟作為蛋白生產工廠，這樣只需要編輯少量肝細胞就能產生治療水平的蛋白，」Holmes說。

這種經過優化的ZFN有著出色的特異性，且脫靶修飾的水平低於深度測序的檢測極限。「在基因組指定的位點獲得80%以上的編輯效率，且脫靶效應低於檢測限，這種能力正是治療性的基因編輯所需要的，」Holmes補充說。

Sangamo的鋅指平台對基因組所做的修飾在遺傳上是穩定的。試劑的作用是瞬時的，但它們賦予的性狀卻是永久的。「天然的進化動力當然存在，這會導致細胞在許多代後不分裂，或丟失染色體。不過，它與未經過編輯的基因組相比既沒有增加，也沒有減少，」Holmes解釋說。

Proxy-CRISPR

當然，CRISPR在許多應用上還是具有獨特的優勢。Rook認為，CRISPR設計簡單，讓研究人員能輕鬆獲得現成的CRISPR全基因組文庫。此外，與ZFN和TALEN相比，它的切割效率提高，也增加了其在全基因組篩選和單個靶點編輯中的應用。

MilliporeSigma最近宣布對CRISPR進行改進，以便讓這個工具更加高效、靈活和特異。他們將利用Proxy-CRISPR來接近那些之前無法觸及的基因組區域，從而加速藥物開發和基因治療。這種方法最近表達在《Nature Communications》雜誌上。

Proxy-CRISPR利用CRISPR的兩次結合來實現高效切割。第一次結合是利用缺乏DNA核酸內切酶活性的Cas9；第二次是通過同樣無法單獨切割人類DNA的CRISPR系統。據Rook介紹，這種策略是模擬天然存在的現象，因為許多不同的CRISPR系統與不同的DNA序列結合。

Proxy-CRISPR允許DNA靶點是多樣化的，就好像許多個體的致病位點都有所不同。「為了糾正各種可能的致病突變，這就需要編輯技術能夠靶定幾乎所有的DNA序列，」Rook談道。「Proxy-CRISPR方法為使用各種CRISPR變體打開了大門，它們能夠揭開基因組差異的意義。」

靈活應用

Poseida Therapeutics也發現，CRISPR技術的改進能夠克服脫靶效應。這家公司最近發布了臨床前數據，表明它家的高保真基因組編輯系統NextGEN? CRISPR可以產生「萬能供血者」嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）。大家都知道，這是癌症免疫治療的重要平台。

Poseida目前已經積累了多個基因編輯平台。除了NextGEN CRISPR，Poseida還採用piggyBac? DNA修飾系統、XTN? TALEN位點特異核酸酶以及Footprint-Free?基因編輯。

「對於不同類型的細胞而言，沒有一種永遠無敵的技術，具體要取決於你想做什麼，」Poseida的CEO Eric Ostertag說。「CRISPR試劑設計起來更簡單、更快速，比TALEN也略為便宜。但是，如果你有TALEN的經驗，並且打算上臨床，那麼成本和設計上的差異幾乎可以忽略不計。」

NextGEN CRISPR的優勢在於它可以應用在活化和靜息的T細胞，這與很多隻作用在活化細胞上的技術相比就具有更大的靈活性。Ostertag表示：「乾性表型對產品效果和持續時間都是至關重要的，因此我們傾向於改造靜息細胞。」NextGEN CRISPR在靜息T細胞上效果很好，但TALEN不行。

野生型的CRISPR利用Cas9蛋白和嚮導RNA來切割DNA。作為天然的核糖核蛋白，它的切割效率很高，但非常馬虎，帶來一些不想要的脫靶突變。Poseida的NextGEN CRISPR則使用了類似鋅指和TALEN的核酸酶，需要兩部分同時存在才能切割，從而保證了on-target的特異性。

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