細胞凍存和復甦實驗方法

細胞凍存和復甦可以：（1）用於生物學保種；（2）用於醫學上幹細胞研究；（3）用於傳代培養。

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實驗方法原理

細胞凍存及復甦的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

目前細胞凍存多採用甘油或二甲基亞碸作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由於冰晶形成造成的細胞損傷。

復甦細胞應採用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

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實驗步驟

一：材料準備

儀器：凈化工作台、離心機、恆溫水浴箱、冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。

玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、廢液缸。

塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10 ml）、15 ml 離心管、凍存管（1～2 ml）。

其他物品：微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、醫用橡皮膏、移液槍。

試劑：D-Hanks 液、小牛血清、培養液、雙抗（青黴素、鏈黴素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。

二：細胞凍存

配製含 10% DMSO 或甘油、10～20% 小牛血清的凍存培養液。

取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至 15 ml 離心管中。

離心 1 000 rpm，5 min。

去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配製好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為 5×106/ml～1×107/ml。

將細胞分裝入凍存管中，每管 1～1.5 ml。

在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

凍存：標準的凍存程序為降溫速率 -1～-2 ℃/ min；當溫度達 -25 ℃ 以下時，可增至 -5 ℃～-10 ℃/min；到 -100 ℃ 時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入 -20 ℃ 冰箱 2 h ，然後放入 -70 ℃ 冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

三：細胞復甦

從液氮容器中取出凍存管，直接浸入 37 ℃ 溫水中，並不時搖動令其儘快融化。

從 37 ℃ 水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管並滴加 10 倍以上培養液，混勻。

離心， 1 000 rpm，5 min。

棄去上清液，加入含 10% 小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37 ℃ 培養箱靜置培養。

次日更換一次培養液，繼續培養。

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注意事項

從增殖期到形成緻密的單層細胞以前的培養細胞都可以用於凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液。

將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

凍存和復甦最好用新配製的培養液。

凍存和復甦的原則：慢凍快融

慢凍程序

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