李海濤、朱勁松合作開發三維卡賓 SPR 成像微陣列技術進行高通量表觀遺傳互作篩選

8月14日，清華大學李海濤研究組和中科院國家納米科學中心朱勁松研究組合作於《美國科學院院刊》（PNAS）在線發表題為「Kinetic and high-throughput profiling of epigenetic interactions by 3D-carbene chip-based surface plasmon resonance imaging technology」（基於三維卡賓晶元的表面等離子體共振成像技術動態高通量檢測表觀遺傳互作）的研究論文，報道了基於三維表面和卡賓化學的表面等離子體共振成像（SPRi）微陣列技術在檢測生物分子互作尤其是修飾依賴互作中的應用。

圖 1：利用三維卡賓晶元 SPRi 技術篩選表觀遺傳互作

生物分子間相互作用，尤其是基於動態修飾的生物分子間識別互作，是生命活動在分子層面的具體體現，也是生命調控的重要生化分子基礎。因此，發現和鑒定生物分子互作對在一定意義上是了解信號轉導、基因調控、以及功能複合物形成的基礎和前提。目前，鑒定生物分子互作的生化或生物物理手段主要包括免疫共沉澱（Co-IP）、親和標籤拉下（pull-down）、凝膠遷移（EMSA）、熱遷移 (TSA)、等溫滴定量熱（ITC）、核磁滴定（NMR titration）、表面等離子體共振（SPR）、生物膜層干涉（BLI）、熒光偏振（FPA）、熒光共振能量轉移 (FRET)、微量熱泳動（MST）、以及基於熒光的微陣列晶元技術等。其中以 ITC 為代表的互作手段可以定量檢測相互作用，但檢測的通量往往不高，而且樣品消耗量大；而熒光晶元等技術雖然有著極高的檢測通量，很少的樣品消耗量，但定量檢測較為困難。因此，開發並優化生物分子互作的高通量、高靈敏度、定量檢測技術對於深入理解生命活動及其調控的生化分子基礎有著重要意義。

李海濤教授長期致力於新型表觀遺傳互作對的發現及其分子識別機制研究，先後發現並闡明了包括 YEATS、PHD 鋅指等在內的一系列「閱讀器」（reader）結構域識別組蛋白醯基化、甲基化等修飾的分子基礎和調控機制。值得一提的是，在上述組蛋白「修飾 - 閱讀器」互作對的發現過程中，德克薩斯大學石曉冰教授開發的基於熒光的修飾多肽陣列晶元發揮了重要推動性作用；近期，李海濤研究組與德克薩斯大學 Mark Bedford 教授合作在《自然化學生物學》(Nat Chem Biol) 發文，利用蛋白陣列晶元研發特定「閱讀器」靶向的小分子抑製劑。上述工作均突出了「lab-on-chip」微陣列技術在表觀遺傳互作發現中的重要作用。國家納米科學中心朱勁松研究員長期從事三維表面化學和 SPRi 微陣列技術的開發。其中表面等離子體共振（SPR）技術主要通過測量分子結合導致晶元表面折射率變化來檢測多種生物分子的結合過程。傳統的 SPR 生物感測器採用線性 CCD 直接測量晶元表面共振角的變化，只能進行少數幾個位點的檢測。而 SPRi 技術將傳統的 SPR 技術與成像技術相結合，採用二維 CCD 對晶元表面進行攝影，通過對影像明暗變化的檢測，平行計算出多個位點的折射率的變化，從而實現生物分子互作信息的高通量捕獲。在《美國科學院院刊》發表的長文中，李海濤研究組同朱勁松研究組緊密合作，利用卡賓化學隨機交聯生物分子、三維表面高信噪比和低位阻效應、以及 SPRi 實時動態平行監測等特性，實現了高通量定量檢測生物分子相互作用。

研究人員首先通過一系列表面化學優化成功在一張 SPRi 晶元上實現了包括多肽、蛋白（抗體）、DNA 和 RNA 在內的多種類型生物分子的列印固定和微陣列製備（集成度可達數百至上千個點 / 晶元，樣品消耗僅 1 -10pmol/ 陣點）。由於卡賓自由基十分活躍，可以插入到生物分子中普遍存在的 C - H 鍵中，進而實現生物分子的高度隨機交聯固定。這一策略一方面可以實現生物分子的非標記固定，免除了諸如生物素標記等額外環節，並降低了成本；另一方面交聯的高度隨機性也最大程度保證了被固定分子的全頻譜取向和功能保留，避免了定點固定可能導致的結合假陰性。此外，交聯所採用的三維晶元表面，相比於普通二維表面大大提高了固定容量並降低影響結合的空間位阻效應，提高了信噪比。在此基礎上，利用 PlexArray HT SPRi 分子互作檢測儀，研究人員實現了針對晶元內容的實時動態無標記結合檢測。數據表明，該體系對於多肽 - 蛋白互作，抗體 - 抗原互作，雙鏈 DNA- 蛋白互作， 單鏈 RNA- 蛋白互作均有效。值得一提的是，該方法成功檢測出了 RNA 甲基化「閱讀器」YTHDF1 對 m6A 修飾 RNA 的特異識別，表明了本技術在新興的核酸修飾識別因子發現方面的潛力。隨後，研究人員通過固定 125 種修飾組蛋白多肽連續檢測 8 種已知組蛋白閱讀器，基於三維卡賓晶元的 SPRi 技術可以快速實現對 1000 對相互作用的高通量動力學檢測，篩選結果與領域報導高度一致。通過該技術平台，研究人員發現人源轉錄元件 TAF3 的 PHD 鋅指結構域可以同組蛋白 H3 賴氨酸 4 乙醯化（H3K4ac）發生亞毫摩爾級的弱結合；以及薺菜中 DNA 損傷修復因子 MSH6 的氨基端 Tudor 結構域可以同組蛋白 H3 賴氨酸 4 三甲基化（H3K4me3）發生微摩爾級強結合。隨後的等溫滴定量熱或複合物晶體結構解析驗證了上述發現，進一步證實了基於三維卡賓晶元的 SPRi 平台在檢測弱相互作用及發現新型表觀遺傳互作對方面的能力。

本工作由李海濤研究組和中科院國家納米科學中心朱勁松研究組聯合完成。李海濤研究組博士生趙帥和朱勁松研究組博士生楊墨為本論文共同第一作者，博士生周文菲，張柏超，黃嘉欣，張敏，王瑞及程志強博士，汪之又博士，陳忠磊博士參與了本項研究。本項目得到科技部重點研發計劃，國家自然科學基金、生命科學聯合中心、北京市結構生物學高精尖創新中心（清華）等資助。儀器設備使用得到「鳳凰工程」蛋白質基礎設施（清華）支持，衍射數據收集得到上海同步輻射光源 BL17U1 線站的大力支持與協助。

原文檢索：

Kinetic and high-throughput profiling of epigenetic interactions by 3D-carbene chip-based surface plasmon resonance imaging technology

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