五步法讓你研究分子機制再也不愁！

知識 08-03

分子機制研究是大家最為頭痛的主題，今天我們就來分享一下研究分子機制的經驗和套路：

（1）信號通路;

（2）明星分子;

（3）中心法則;

（4）工具分子;

（5）具體位點;

（1）信號通路

信號通路千千萬，找到一條是關鍵，通路關係太複雜，講不清楚就完蛋！

確定信號通路的方法有很多，特別是當我們已經把一個基因的細胞和動物功能闡述清楚後:

1）通過文獻報道或者已知經驗，比如分子A的功能是影響細胞自噬，那麼像PI3K-Akt-mTOR通路等就是我們可以直接通過閱讀綜述獲取的；

2）通過RNA-seq或者晶元或者其它組學手段，篩選差異基因並對差異基因進行pathway或者GSEA富集分析，從而找到可能被基因A調控的信號通路；

3）通過資料庫預測，比如基於與基因A存在共表達關係來分析周圍基因所參與的通路，從而得到A可能參與的通路，我們可以通過cbioportal/GEPIA對TCGA收錄腫瘤中的信息進行分析，也可以分析GEO等非腫瘤的共表達結果，甚至有一些網站直接收錄了這種共表達關係。

（2）明星分子

明星分子選得好，文章分數才能高，中游節點最常選，上下連接有得搞！

明星分子的概念大而且含糊，儘管通路是一個大的網路，但是總體上上下游關係還是存在的，如果簡單來劃分可以分為上游，中游和下游三段，三者之間沒有嚴格的界限，一般的通路常常出現分子類型有：配體與受體，激酶/磷酸酶（去/泛素化酶）與底物，轉錄因子和靶基因等，以TGFβ-Smad通路為例，如果把細胞膜和核膜作為上中下分類的區分點，可以粗略的這麼劃分和標註：

那麼在這個通路裡面什麼分子是明星分子呢？一般來說，大家選的重點集中在中游這個範圍內，下游的分子（比如圖中的p15）一般用來作為細胞表型（細胞周期）的證據，可能考慮到膜蛋白研究的複雜和困難性，大家也很少選擇上游的分子，所以中游的分子就成了明星分子選擇的重點了，特別是通路的名字叫做TGFβ-Smad，所以很多研究就是圍繞Smad這個蛋白展開，比如Smad這個家族的蛋白即是轉錄因子，可以通過結合靶基因的DNA調控分子表達，其本身又可以被磷酸化發揮功能，所以又是激酶-底物這一關係中的底物這一角色，因此激酶-Smad-磷酸化的Smad（轉錄因子）-靶基因就成了一個信號軸。

（3）中心法則

中心法則像樓梯，三個水平N多級，從大到小逐層找，推理驗證少不了！

當我們選好明星分子以後，調控層次就是要考慮的問題了，這裡說的調控層次就是圍繞中心法則展開對明星分子本身的探索，我們知道中心法則涉及到DNA-RNA-蛋白三個層面，根據調控的層次一般我們又分為轉錄水平和轉錄後水平，轉錄我們知道是發生在細胞核裡面的。所以我們看到某個分子定位在細胞核時我們一般就從轉錄水平進行考慮，比如轉錄因子對DNA序列的結合，DNA甲基化、組蛋白修飾等等，而當RNA被轉錄出來後要經過加工過程，比如可變剪接，miRNA介導的降解，mRNA翻譯成蛋白，蛋白合成後會被磷酸化修飾或者泛素化修飾從而激活或者降解等等，這些是轉錄後的水平。那麼我們在確定明星分子後，一般來說需要首先確定的是變化發生在哪個層面，是RNA還是蛋白，是蛋白的產生（翻譯）、降解（比如泛素化）還是活化（比如磷酸化），從而把研究的焦點集中到明星分子的某個過程，這個層面是圍繞一個明星分子的前世今生來展開的。

（4）工具分子

一個結果多個因，工具分子一大群，具體哪個有作用，IP驗證指乾坤！

確定了明星分子在哪個層面被調控後，就要找相應的工具分子了，工具分子是指像酶（比如激酶、泛素酶、甲基化酶）、轉錄因子、翻譯因子、剪接因子等為主的一系列蛋白，每個系列的工具分子一般都有很多，比如泛素酶就有成百上千個，那具體是哪一個導致明星分子被泛素化呢？以免疫沉澱（IP）技術為基礎延伸出來的各種分子就是用來找這類工具分子的最常用策略，比如通過IP加質譜鑒定與明星分子作用的泛素化酶，通過RNA pulldown加質譜鑒定與RNA結合的工具蛋白（如翻譯因子和剪接因子），通過RIP-seq來尋找與蛋白結合的RNA，通過ChIP-Seq來尋找與蛋白結合的DNA序列（如靶基因）等等。找到工具分子後，作用的信號軸就有了：某基因（因素）通過（4）工具分子從（2）明星分子（3）某個層面調控（1）某條信號通路。

(5) 具體位點

分子整體有作用，具體位點講不清，拆開組合來驗證，整個世界都安靜。

這一步就是要進一步把明星分子和工具分子進行拆解，工具分子揍了明星分子一頓，具體是揍了一拳還是踢了一腳，工具分子的一拳打在了明星分子的臉上還是肚子上，這個是兩個要交代清楚的問題，所以就要把工具分子和明星分子中發揮功能的位點、序列或者結構域找到，找到後就可以更加清楚的描述了：工具分子左拳打在了明星分子頭上，具體位置是打在了太陽穴上，把明星分子打死了，這樣導致一個以明星分子為中心的網路（信號通路）出現崩潰或者癱瘓，異常（疾病）就出現了。所以我們在文章中常常看到要把蛋白根據結構域進行分段，把RNA根據序列長度進行分段，然後再看他倆之間還有沒有作用。比如大家當做笑話來看的一個實驗，一研究人員把一隻蜘蛛放在桌上，對它大喊一聲，蜘蛛嚇跑了；把蜘蛛的腿全撕了，對它大喊一聲，蜘蛛沒跑，所以結論是：蜘蛛的耳朵是長在腿上的。