韓春雨找出實驗難重複的原因？何必糾結NgAgo，CRISPR月內獲3大突破

作者：解螺旋.葉子

導語

11月23日，Nature發表了「NgAgo基因編輯爭議在同行評議論文中升級」的報道，是NgAgo再次處於爭議的中心。然而在這個月里，另一個大火的基因編輯工具CRISPR相關科研成果確是不斷刷屏，

11月23日晚間，Nature發表了「NgAgo基因編輯爭議在同行評議論文中升級」的報道。其中，韓春雨說他已經發現了一個問題，這個問題可能被他人忽視但可以用來解釋為什麼難以重複他的實驗。他正在進行確認工作，以保證發表的實驗操作和數據能讓批評者滿意。

與這飽受爭議的「NgAgo」相比，CRISPR技術則是成績斐然，屢獲進展，在這個月就被CRISPR的多項技術突破所刷屏，中國的川大華西的成果更是令中國學術界所振奮，「遠超美國了。」

CRISPR結合PD-1首次應用於人體

四川大學華西醫院全球首個CRISPR技術的人體應用在7月通過了倫理審批，10月正式啟動。這項試驗招募對象是非小細胞肺癌，且癌症已經擴散的患者，經化療、放療以及其他治療均無效。

科研人員從患者體內分離出T細胞，用CRISPR進行基因編輯，敲除了抑制PD-1的基因，進行體外擴增。細胞到一定數量後，再輸回患者體內。本次試驗計劃治療10名患者，他們每人將接受2-4次注射。

Steve Gschmeissner/Science Photo Library

由於腫瘤細胞是通過上調PD-L1表達並與腫瘤特異性的CD8+T細胞表面PD-1結合，限制了宿主的免疫反應。簡單的說，就是有PD-1的免疫細胞是殺不過腫瘤細胞的。而目前的PD-1抗體，Opdivo和Keytruda是通過阻斷PD-1來治療晚期非小細胞肺癌，效應率為15%-25%，而對於晚期鱗狀肺癌，效應率為33%。但是，PD-1抗體對很大一部分患者沒反應。

本次試驗的主要目的是檢驗這項療法的安全性。這些參與試驗的患者將得到長達半年的密切監護，以了解此項療法是否能對這些「無葯可治」的患者帶來益處，又是否會產生嚴重的副作用。如果這次臨床試驗被成功執行，中國將保持一系列CRISPR領域「No.1」的記錄：第一個CRISPR編輯的人類胚胎，以及第一個CRISPR編輯的猴子都在中國誕生，結果讓我們拭目以待吧。

參考文獻：CRISPR gene-editing tested in a person for the first time

成功用人工病毒進行CRISPR/Cas9輸送

這項成果出自同是四川大學華西醫院的魏於全課題組，首次採用人工病毒進行CRISPR/Cas9輸送，成功在小鼠腫瘤模型中完成了靶基因編輯，達到了較好的腫瘤治療效果。這個實驗的亮點在哪呢？以前的人體實驗都是在體外進行基因編輯，完事後再回輸體內。

這樣人們就會想到，能不能直接在體內進行編輯呢？目前體內給葯CRISPR質粒DNA的手段有三種，第一種是水流動力學注射，也就是打點滴，將大約是小鼠體重10%的DNA質粒注射液通過尾靜脈在3-8秒內注射到小鼠體內，但這種方法會造成血壓瞬間升高，產生器官損傷，在人體上用更是沒戲。第二種是局部注射，也就是打針，缺點么，對於人體深部輸送得要多長的針頭啊。第三種是用腺病毒載體進行輸送，但腺病毒有免疫原性，有可能會引起免疫反應，而且CRISPR質粒DNA很大，腺病毒負載不夠，效率不高。

既然這些方法都有缺陷，就要另闢蹊徑了，課題組合成了一種新的人工病毒來輸送CRISPR/Cas9質粒DNA。他們合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因的CRISPR/Cas9質粒DNA（Cas9-hMTH1）在小鼠體內進行了實驗驗證。為了增強人工病毒的輸送效率，用了多功能高分子RGD-R8-PEG-HA對人工病毒進行修飾得到了終極產物，靶向MTH1的多功能核殼結構CRISPR/Cas9輸送人工病毒（RRPHC/Cas9-hMTH1）。

這種高分子可以使人工病毒更穩定，同時避免被免疫系統清除，RGD和HA可以同時靶向結合腫瘤部位高表達的整合素ανβ3和CD44受體，從而提高人工病毒在腫瘤部位的富集。經過體外細胞轉染實驗驗證該方法的轉染效率高於商用轉染試劑，功能性實驗也表明該人工病毒可以成功敲除MTH1，顯著抑制乳腺癌細胞增殖。最後經過安全性評價，血細胞計數發現注射人工病毒對血細胞數量無明顯影響，基因測序顯示正常組織中的突變率均低於0.4%，且都不是插入或者缺失突變，僅為單鹼基替換突變，顯示出人工病毒+CRISPR的良好應用前景。

參考文獻：Artificial Virus Delivers CRISPR-Cas9 System for Genome Editing of Cells in Mice

CRISPR首次對非分裂細胞進行基因編輯

第三個研究是美國加州大名鼎鼎的SALK研究所首次在基因組的靶位點上將DNA插入到非分裂細胞。基於CRISPR/Cas9技術，作者發明了一種同源非依賴性靶向插入技術（HITI），不但可以在體外條件下，顯著提高外源基因插入分裂細胞和非分裂細胞的效率，更為重要的是，在體內條件下也可以達到相同的效果，利用HITI技術還可以提高大鼠色素性視網膜炎模型中的視覺功能。

HITI技術即同源非依賴性靶向插入。通過優化非同源性末端接合（NHEJ）的DNA修復通路，將其與CRISPR技術相結合，創建了一個由混合核酸組成的定製插入包。首先，在體外條件下，利用常規工具細胞株HEK293，檢測HITI方法介導的基因編輯。觀察HITI技術在遺傳性疾病模型中的糾正能力，這裡採用大鼠色素性視網膜炎模型。

進一步將HITI技術整合到目前基因治療中相對安全的病毒中，即腺相關病毒AAV，檢測全身給予AAV介導的HITI是否具有治療效果。

這是首次表明HITI可能在非分裂細胞中發揮作用。其美妙之處在於它可適應於任何靶向基因組編輯系統，而不僅僅是CRISPR/Cas9。因此，隨著這些系統的安全性和有效性得到改善，HITI的有效性也將會得到改善。

參考文獻：In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration

可以看到，目前CRISPR還是最火的基因編輯工具。在中國，CRISPR沒有很多羈絆而飛速發展，已經處於領先水平。該技術與之前的基因編輯技術相比，效率高，適應面廣，而且操作簡單，周期相對較短。這讓基因編輯技術的廣泛應用和普及成為可能。近年來，相當多的文章報道了應用CRISPR/Cas9方法在不同物種中實現了基因敲除、插入和突變的案例。

因此，解螺旋開展基因編輯CRISPR-Cas9培訓班，講師們對CRISPR-Cas9基因編輯技術在非編碼RNA、腫瘤、基因治療等研究領域的應用有深入的理解。他們會為您詳細介紹CRISPR-Cas9技術操作，讓您快速掌握技術難點；並總結基因編輯與CRISPR-Cas9文章發表的思路，讓您學會此類文章的設計寫作套路。

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