Plant Cell Physiol：新方法讓CRISPR/Cas9高效地敲除擬南芥中的靶基因

2016年12月11日/生物谷BIOON/---在一項新的研究中，來自日本名古屋大學轉化生物分子研究所的兩名生物學家Hiroki Tsutsui和Tetsuya Higashiyama開發出一種新的載體（一種轉運遺傳信息的載體），從而允許高效地和可遺傳地敲除模式植物擬南芥中的靶基因。相關研究結果近期發表在Plant and Cell Physiology期刊上，論文標題為「pKAMA-ITACHI vectors for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Arabidopsis thaliana」。

基因組工程涉及對宿主基因組的一部分進行特異性修飾，即移除、添加和改變宿主基因組中的DNA序列片段。迄今為止，CRISPR/Cas9系統因其簡易性、多功能性和高效性而成為一種最為流行的基因操縱方法之一。

然而，對擬南芥而言，CRISPR/Cas9的突變誘導效率在某種程度上一直都比較低。這是因為誘導基因突變的Cas9是在細胞的發育階段後期被激活的。因此，為了獲得所需的靶基因被敲除的植物物種，人們就需要大量的時間、精力和植物物種。

CRISPR/Cas9系統由兩個關鍵的分子組成：一種被稱作嚮導RNA（gRNA）的RNA片段和一種被稱作Cas9的核酸酶。Cas9是一種分子剪刀，能夠在基因組特定位點上切割DNA的雙鏈，這樣就能夠在該位點上添加或移除DNA序列。另一方面，gRNA是一種事先設計好的位於一種更長的RNA骨架內的RNA片段（大約長20個鹼基）。這種RNA骨架結合到DNA上，這樣這種事先設計好的RNA序列引導Cas9到基因組的特定部分，因此Cas9就能夠在靶位點上進行切割。

Tsutsui說，「通過使用RPS5A基因---在植物細胞的胚胎髮育初期表達---的啟動子，我們能夠誘導Cas9高效地敲除植物卵細胞中的基因。這個RPS5A啟動子在卵細胞中是有活性的，因此我們決定將這個分子工具稱為pKAMA-ITACHI Red（pKIR）載體。相對於在植物中經常使用的35S啟動子，該分子工具能夠高效地編輯植物基因組。」

Higashiyama說，「通過能夠高效地敲除擬南芥中的靶基因，我們將這種工具視為一種闡明植物基因功能的有前途的方法。我們希望我們能夠利用這種方法進行歐洲油菜等作物基因組編輯，從而加快它們的生長和培育出多種植物品種。」

這種CRISPR/Cas9系統通過敲除一種特定的基因來研究它的功能。在擬南芥中，由於Cas9是在細胞的發育階段後期表達的，因此基因敲除的程度依據組織的不同而存在差異。因此，這種基因組突變效率相對較低。

比如，當利用植物中一種經常使用的35S啟動子在擬南芥中表達Cas9時，儘管在葉子中觀察到大量的基因敲除，但是在花朵中僅檢測到少量基因敲除。這提示著靶基因的敲除突變效率在花朵的生殖細胞中相對較低。因此，這種敲除突變很難傳遞到下一代的子細胞中。

為了解決這個問題，Higashiyama團隊決定在植物卵細胞和胚胎髮育早期期間的細胞中表達Cas9以便提高靶基因敲除效率。

Higashiyama團隊首先試圖敲除PDS3基因，其中已知該基因負責合成植物中的葉綠素。若缺乏葉綠素，植物變成一種白化物種。通過利用pKIR表達Cas9，Tsutsui成功地觀察到PDS3基因被敲除，這可通過產生一種白化植物加以證明。

Tsutsui也研究了當PDS3基因被敲除時，它對葉綠素在花莖中的合成數量的影響。當利用35S啟動子表達Cas9時，葉綠素數量與野生型中觀察到的數量僅有微量的差別。另一方面，當利用pKIR誘導Cas9表達時，葉綠素數量顯著下降，這提示著該基因被高效地敲除。

Higashiyama團隊也發現pKIR載體成功地敲除擬南芥中的其他基因，如AGAMOUS、DUO1和ADH1。

為了容易地鑒定出攜帶CRISPR/Cas9基因的植物物種，含有Cas9的種子利用紅色熒光加以標記。

Higashiyama團隊發現利用pKIR載體表達Cas9對擬南芥基因組進行高效編輯的方法能夠敲除早期發育階段期間的細胞中的基因，並且誘導能夠傳遞到下一代的子細胞中的突變。

Tsutsui說，「這種pKIR方法允許我們研究可能具有重疊功能的基因簇。在此之前，我們不得不通過讓現存的突變株進行雜交產生多種基因敲除植物來研究重疊的基因功能，這非常耗費時間。利用我們的相對低成本的方法，我們能夠快速地獲得突變株，從而應當能夠研究未被鑒定出的基因簇的功能。」（生物谷 Bioon.com）