中國科學家應用優化的CRISPR技術建立基因完全敲除的小鼠及猴模型

導 語

2017年6月6日，Cell Research雜誌在線發表由中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心的楊輝研究組、熊志奇研究組以及神經所蘇州非人靈長類研究平台孫強團隊合作完成的題為Homology-mediated endjoining-based targeted integration using CRISPR/Cas9的研究論文。

利用CRISPR基因編輯技術，研究人員能夠通過簡單的「一步反應」，徹底敲除小鼠或是猴子體內的特定基因。這一工具對於基礎科研中動物模型的建立能起到提速的作用，意義重大。

研究背景

精準編輯與嵌合現象

CRISPR技術可按研究人員的需求高效敲除動物體內的特定基因，做到「精準編輯」。但在實際操作中，動物體內總有一些漏網的細胞，逃脫了CRISPR的編輯，被稱為「嵌合現象」。這種出現嵌合的動物往往需要幾代的培育和雜交，才能得到基因被完全敲除的個體，因此無法通過「一步法」來產生沒有嵌合的基因修飾動物。當涉及大型動物，嵌合體的問題就會顯得尤為嚴重，如獼猴繁殖周期長達5-6年而且每胎只生一個幼崽。

「一步法」的嘗試與限制

先前，有許多研究者都試圖通過「一步法」來產生沒有嵌合的基因修飾動物，如：將Cas9 mRNA和sgRNA注射到卵母細胞中而非受精卵中，或注射Cas9蛋白，或注射雙sgRNA。但是DNA測序分析了這些方法的動物個體組織後，發現這些方法完全做到雙等位基因敲除的效率相當低。一些科學家嘗試將Cas9的mRNA與嚮導RNA（sgRNA）注射入卵母細胞（oocyte），而不是常用的受精卵（zygote）；一些科學家嘗試過直接注射Cas9蛋白；另一些科學家則注射過多條sgRNA。這些實驗都取得了一定的成果，但獲取基因被完全敲除的動物的效率較低，從而限制了它們的應用。

本研究的設想：如果在受精卵內注射多條sgRNA，是否會提高基因敲除的效率呢？

結果速覽

研究通過將多個針對基因外顯子的連續指導RNA（sgRNA）注射到受精卵中，可以高通量製作各種基因完全敲除小鼠並用於表型分析，並快速製作基因敲除猴模型。

這項研究中，研究者發現向受精卵當中注射Cas9 mRNA和多個sgRNA的雞尾酒式混合物，單個或多個基因在小鼠胚胎能做到100%的完全刪除，以及猴子胚胎中91%-100%的刪除。這種方法能同時產生插入缺失和外顯子刪除，從而實現高效的基因完全敲除。研究者還應用C-CRISPR法建立基因功能完全敲除的F0代小鼠，用於基因功能的快速表型分析，以及獲得基因功能完全敲除的F0代猴。最後，通過高通量測序分析顯示，C-CRISPR在基因編輯過的小鼠和猴子中不會引入明顯的脫靶改變。

圖註：一步法獲得基因完全敲除的小鼠和食蟹猴。A. 小鼠Tyr基因sgRNA靶向位點示意圖。B.注射Cas9 mRNA合并多個毗鄰的sgRNA進入小鼠受精卵。C.食蟹猴Prrt2基因sgRNA靶向位點示意圖。D.MII卵子單精子注射發育到原核期受精卵，隨後注射Cas9 mRNA合并多個毗鄰的sgRNA。

團隊成員

該項工作由博士後左二偉、助理研究員蔡毅君、博士後李奎、研究生魏瑜、博士後王邦安在靈長類疾病模型研究組研究員楊輝、疾病神經生物學研究組研究員熊志奇與蘇州非人靈長類研究平台主任孫強的指導下完成，課題組的其他成員積极參与，並得到了上海生科院生物化學與細胞生物學研究所研究員李勁松、徐國良的大力協助，是眾多課題組通力合作的重要成果。該工作得到中科院戰略性先導科技專項(XDB02050007, XDA01010409)、國家高科技研發項目(863項目; 2015AA020307)、國家自然科學基金會(國家自然科學基金委資助31522037和31500825)、中國青年千人計劃(楊輝)、中科院重大突破項目、上海青年科學人才培養計劃(15YF1414700)、國家關鍵技術研發項目(2014BAI03B00, 孫強)、上海市科學技術委員會項目 (16JC1420202, 楊輝; 14140900100, 孫強)、中科院百人計劃(孫強)等項目的資助。

ABSTRACT

Targeted integration of transgenes can be achieved by strategies based on homologous recombination (HR), microhomology-mediated end joining (MMEJ) or non-homologous end joining (NHEJ). The more generally used HR is inefficient for achieving gene integration in animal embryos and tissues, because it occurs only during cell division, although MMEJ and NHEJ can elevate the efficiency in some systems. Here we devise a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy, using CRISPR/Cas9-mediated cleavage of both transgene donor vector that contains guide RNA target sites and ~800 bp of homology arms, and the targeted genome. We found no significant improvement of the targeting efficiency by the HMEJ-based method in either mouse embryonic stem cells or the neuroblastoma cell line, N2a, compared to the HR-based method. However, the HMEJ-based method yielded a higher knock-in efficiency in HEK293T cells, primary astrocytes and neurons. More importantly, this approach achieved transgene integration in mouse and monkey embryos, as well as in hepatocytes and neurons in vivo, with an efficiency much greater than HR-, NHEJ- and MMEJ-based strategies. Thus, the HMEJ-based strategy may be useful for a variety of applications, including gene editing to generate animal models and for targeted gene therapies.

資料來源：中科院網站

http://www.cas.cn/syky/201706/t20170607_4604127.shtml

http://www.cell-research.com/arts.asp?id=2433

本期編輯：Annabella

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