環狀RNA circRNA研究現狀

知識 09-09

環狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，也是RNA領域最新的研究熱點。與傳統的線性RNA（linear RNA，含5』和3』末端）不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。

在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）結合位點，在細胞中起到miRNA海綿（miRNA sponge）的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，進而在轉錄水平上對靶基因進行調控；這一作用機制被稱為競爭性內源RNA（ceRNA）機制。通過與疾病關聯的miRNA相互作用， circRNA在疾病中發揮著重要的調控作用。

一、環狀RNA相關研究

環狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類新近發現的內源性非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），是最近RNA領域的最新的研究熱點。Sanger等在20世紀70年代發現某些高等植物中存在可致病的單鏈環狀類病毒，這是人類首次發現cirRNA。隨後人們陸續在酵母線粒體、丁型肝炎病毒中發現cirRNA，也發現在小鼠的睾丸內含有性別決定基因（sex-determining region Y, Sry）轉錄而來的cirRNA，還證實了cirRNA也存在於人體細胞。

隨著高通量測序及生物信息學的快速發展，越來越多的cirRNA在生物體中被發現，它們廣泛的，多樣化的，保守的，穩定的存在於真核生物中，豐富了RNA家族的內容。不同物種中鑒定的cirRNA數目是不一樣的，總結目前已經發表的研究中cirRNA的鑒定情況如下：

劉駿武研究植物水稻的cirRNA，利用總RNA-seq數據，分別利用find_circ、STAR、CIRI三種軟體同時進行預測，只選取具有canonical位點的環狀RNA，分別找出 20、155、69 個，取三個軟體結果的並集，總共有 213 個環狀 RNA。植物擬南芥選取經過Poly（A ) 富集的RNA-seq數據，利用find_circ、STAR、CIRI 三種流程預測環狀 RNA，分別預測出 canonical類型的為 17、2、14 個，取三種軟體的並集共24個環狀 RNA。陳肖等研究報道家蠶體內可能存在300多個cirRNA基因片段。有研究報道，在線蟲體內，利用find_circ流程共鑒定出1531個cirRNA。 Memczak報道HEK293細胞中存在1950種cirRNA，小鼠腦組織中存在1903種cirRNA。Jeck等在人類成纖維細胞中發現了大於25000種RNA含有非共線索尾插接外顯子，揭示了cirRNA產生的一種方式即外顯子跳讀，以及Alu重複序列在cirRNA形成中的作用。

二、環狀RNA的形成機制

根據環狀RNA剪接來源的不同，將其分為外顯子環化形成的環狀RNA（exonic cirRNAs）和內含子環化形成的環狀RNA（cirRNAs）。

1、外顯子環狀RNA的形成機制

外顯子環狀RNA通過反向剪接的方式形成，目前形成機制存在兩種假設：

第1種機制認為在外顯子環狀RNA形成過程中，前體RNA轉錄時發生了部分摺疊，外顯子就會隨著RNA的摺疊出現跳躍現象，這樣在被跨越的部位形成外顯子包含內含子的環狀RNA中間體套索結構，接著套索內部進行剪接，去除內含子序列後形成環狀RNA。

第2種機制認為環狀RNA的形成是由於在形成環狀RNA的前體序列兩側內含子上存在反向互補序列，正是由於兩側內含子的互補配對介導了環狀RNA的形成。由於外顯子環狀RNA在細胞中廣泛存在，且其形成機制尚處於推測階段，因此需要科研工作者對其形成過程中的相關調控及加工方式作進一步的研究。

環狀RNA circRNA研究現狀

外顯子環狀RNA可能的形成機制示意圖

在外顯子環狀RNA的兩種形成機制中，一些證據表明，自身的反向剪接序列可能比外顯子跳躍發生的更頻繁。有些線性mRNA缺失的外顯子，被包含在某個環狀RNA中，說明外顯子跳躍可能也是一個合理的機制。Steven等在研究中通過RNA-Seq和qPCR發現，外顯子跳躍可能誘導環狀RNA的產生。對於兩側內含子互補配對形成環狀RNA的機制，Jeck等研究發現在成環的序列中包含有串聯重複的ALU序列，這種現象與兩側內含子互補配對促進成環的機制是一致的。

2、內含子環狀RNA的形成

在某些組織中，內含子可以獨立環化形成環狀內含子RNA（circular intronic RNA, ciRNA），稱為內含子環化。內含子環化主要存在於細胞核中，它們的形成依賴於含有鄰近5』剪接位點處的7個核苷酸GU富集元件以及3』剪接位點處的的11個核苷酸C富集元件，具有少量的miRNA靶點。

3、外顯子-內含子環狀RNA的形成

有研究學者發現了環化外顯子中間保留有內含子，稱其為外顯子-內含子環狀RNA（exon-in-troncircRNA or EIciRNA），EIciRNA的發生機制尚不明確。

三、環狀RNA的特徵

根據已有文獻報道，circRNA具有以下顯著特點：

與線性RNA不同，circRNA形成沒有3』末端和5』末端的共價環狀結構，因此不易於被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩定。

種類繁多，而且有些circRNA高於其相應的線性RNA10倍之多。

circRNA主要由外顯子構成，少部分由內含子環化形成。

一些circRNA富含microRNA（miRNA）反應元件（microRNAresponse element, MRE），可扮演競爭性內源RNA（competingendogenous RNA）角色，可與miRNA結合，在細胞內發揮miRNA海綿的作用，抑制miRNA發揮功能從而調節基因表達水平。

環狀RNA具有時空特異性。例如，ciRS-7在腦組織中表達較高，而在非神經組織中表達量則較低。DOCK1基因表達的環狀RNA在乳腺癌細胞系MCF-7中呈高表達，而在肺癌細胞系A549中則幾乎不表達。在不同發育時期的線蟲胚胎細胞中，環狀RNA種類及相對表達量均存在顯著差異。時空特異性是環狀RNA具有特定功能的證據，也是將其運用於開發臨床疾病診斷標記物的基礎。

大多數circRNA為內源性ncRNA，僅有部分外源性circRNA是可以翻譯表達的，例如丁型肝炎病毒（hepatitisD virus, HDV）與含有內部核糖體進入位點序列（internalribosome entry site,IRES）的工程circRNA。

環狀RNA不同物質間進化上具有保守性。這些特點顯示circRNA在轉錄水平與轉錄後水平可能發揮著重要作用，可作為疾病診斷的理想標誌物。

四、環狀RNA的功能1、環狀RNA與miRNA的相互作用

ceRNA含有miRNA應答元件（microRNAresponse element, MRE），可通過MRE競爭性結合miRNA。因此，ceRNA可以影響miRNA調節基因表達的功能。近來，越來越多的研究表明circRNA可發揮miRNA海綿或ceRNA的作用。

例如，有研究顯示，外顯子來源的circRNAciRS-7/CDR1as（miR-7或CDR1的環狀RNA海綿）與性別決定域Y（sexdetermination region Y, SRY）可以結合miRNA，而且可逃脫降解，使得他們成為很好的ceRNA替代者。Hansen等發現腦降解相關蛋白1（cerebellardegeneration-related protein 1, CDR1）可翻譯產生一個名為反義腦降解相關蛋白1的自然環化轉錄子（cerebellardegeneration-related protein 1transc ript, CDR1as）。CDR1as可與miRNA結合，並且可由miR-671（microRNA-671）降解。研究證實miR-671可與CDR1as完全互補並引起其降解。

隨後研究證實CDR1as包含有70多個miR-7結合位點，並與大量阿格蛋白（argonaute,AGO）結合。這些結合位點間的互補性可使CDR1as免於降解以及與miR-7結合，而且CDR1as沉默或者miR671過表達都可引起miR-7靶基因表達降低。此外，CDR1as在神經組織中高表達，Memczak等研究斑馬魚發現，使斑馬魚胚胎高表達CDR1as,沉默CDR1，結果發現斑馬魚中腦體積減小，同時模擬miR-7功能缺失，進而引起了中腦形態缺陷，充分證明CDR1as對miR-7的海綿作用。

2、cirRNA是pre-mRNA的調節劑

Ashwal-Fluss等的研究發現，cirRNA上與側翼內含子一樣也具有MBL結合位點，MBL通過與其RNA產生的cirRNA特異性結合，可以反向調節cirRNA本身的合成。他們還發現通過分別提高果蠅和人細胞內有效的線性剪接，發現cirRNA生成的含量減少，說明外顯子環化可以與經典的pre-mRNA剪接相競爭，使環化與線性剪接達到一個平衡的狀態，這一過程是在果蠅與人中是有組織特異性的、保守的。這些都說明了cirRNA可以調節pre-mRNA的剪接，從而影響蛋白質的產生。

3、cirRNA可調控親本基因的表達

最近的研究顯示，cirRNA可以調節親本基因的表達。例如，Zhang等發現cirRNA的形成依賴於關鍵的側翼RNA元件，這些RNA元件對於內含子套索環化逃逸脫支酶分離至關重要。這些cirRNA幾乎沒有miRNA靶點富集，表明他們的功能具有獨特性。

有研究表明，一些circRNA細胞核內含量豐富，通過與聚合酶Ⅱ相互作用以順勢反應方式調控宿主轉錄活性。接著，科學家們又陸續在人類細胞中發現了另外一種可與聚合酶Ⅱ相互作用的circRNA，這種環狀RNA叫做EIciRNAs。EIciRNAs（例如circEIF3J,circPIAP2）主要定位於核內，可與小核糖核蛋白（smallnuclear ribonucleoproteins, snRNPs）相互作用以順勢反應方式調控親代基因的轉錄。

與之類似，Li等發現cir-ITCH及ITCH3"端未翻譯器共有miRNA結合位點；進一步研究發現，cir-ITCH與miR-7、miR-17和miR-214相互作用可上調ITCH表達水平。總之，可以推測外顯子來源的circRNA在細胞質內發揮調節作用，而內含子來源的circRNA（如ciRNA、EIciRNA）則在細胞核內發揮轉錄調節作用。

4、環狀RNA與蛋白質的相互作用

環狀RNA可直接與蛋白質結合，也可通過RNA介導間接與蛋白質發生關聯，影響蛋白質功能。例如，RNA剪切因子MBL可結合其親本基因第2外顯子，促進其環化形成circMbl；同時，circMbl能與MBL結合，降低MBL有效濃度，減少circMbl生成。內含子-外顯子環狀RNAcircEIF3J 與U1RNA結合。促進U1小核核糖核蛋白（U1snRNP）複合體與RNA聚合酶II結合，增強親本基因轉錄。Circ-Foxo3與激酶抑制蛋白（p21）及細胞分裂蛋白激酶（CDK2）形成複合體，抑制CDK2對細胞分裂的促進作用，阻礙細胞周期進展。

5、環狀RNA的翻譯功能

一般情況下，很少有circRNA可翻譯成蛋白質。水稻黃斑駁病毒scRYMV以及人工合成的具有內部核糖體進入位點（internalribosome entry site, IRES）的環形RNA分子在細胞內能夠翻譯成蛋白質。因此，環形結構並非影響RNA編碼的決定性因素。但是，目前在真核細胞內尚無內源性環狀RNA可直接翻譯出蛋白質的證據。Kos等在研究中發現B型肝炎病毒中的環狀RNA衛星病毒肝炎δ產生與致病性相關的單個病毒蛋白。

此外，科學家也報道了circRNA可能的其他功能。例如，circRNA可作為RBP海綿，即MBL與cirMbl的直接相互作用，或作為RB P工廠的裝配或變構調節。另外，circRNA亦可直接通過局部鹼基配對靶向mRNA。一些circRNA甚至可以作為翻譯模板，研究發現，合成circRNA可以高效的翻譯蛋白質。這些發現表明仍需要深入的研究來進一步闡釋circRNA的新功能。

五、環狀RNA的預測方法

根據已發表的文獻，將方法分為三類：

從頭預測（ab initio）的方法：find_circ（如下圖）（Memczak et al.,2013），將不能和基因組比對上讀段的兩端各取20bp作為錨點，再將錨點作為獨立的讀段往基因組上比對並尋找唯一匹配位點，如果兩個錨點的比對位置在線性上方向呈反向，那麼就延長錨點的讀段，直至找到環狀RNA的接合位置（junction），若此時兩側的序列分別為GT/AG剪接信號，則判斷為潛在的環狀RNA；

基於RNA-seq比對工具如：Tophat-fusion（Kim andSalzberg, 2011）、Mapsplice（Wang etal., 2010）、STAR（Dobin et al.,2013）、segemehl（Hoffmann etal., 2014）等，以尋找融合基因的思想檢測環狀RNA（如下圖）：先將不能比對到轉錄本上的讀段提取出來，再根據軟體預測結果找出處於同一條染色體上的融合基因，最後根據基因組注釋文件中外顯子的邊界來判斷是否為環狀RNA；

專門為尋找環狀RNA而設計的演算法和工具（如下圖）如CIRI，它考慮了經典的環狀RNA以及一些短外顯子成環狀RNA的情況，同樣以GT-AG剪接信號和外顯子邊界得到環狀RNA。

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